Dosaggio Del Dna Con Metodo Colorimetrico

tramite: O2O
Difficoltà: facile
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Introduzione

Il dosaggio del Dna è un passo importante dell'analisi scientifica, perché permette di specificare la quantità di materiale genetico estratto da una determinata cellula. Attraverso questo metodo, potremo capire come fare per calcolare la sua concentrazione sfruttando delle semplici analisi spettroscopiche. In questa guida, quindi, vedremo come fare per riuscire ad eseguire correttamente il dosaggio del DNA utilizzando il metodo colorimetrico.

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Per prima cosa poniamo tutto in una cuvetta (sarebbe una sorta di contenitore adatto allo spettrofotometro). In un'altra cuvetta prepariamo una soluzione formata da ACIDO PERCLORICO, ALDEIDE E LA DIFENILAMMINA. Lo lasciamo in incubazione a circa 36-38 gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno dopo, sempre e solo dopo aver indossato guanti, camice, occhiali protettivi, prendiamo la nostra "soluzione". Nel frattempo avrà assunto un colore celeste: solo il DNA sarà di quel colore e potremo separarlo da qualsiasi altra sostanza di natura diversa.

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Separiamo le macromolecole di interesse. Ora prendiamo delle cuvette in cui ci sono state poste concentrazioni crescenti, ma soprattutto note di Dna. È il momento di usare il nostro spettrofotometro. Dopo aver tarato (azzerato) lo strumento con una soluzione di bianco (ovvero solo il solvente usato per la soluzione, in genere acido perclorico) carichiamo le 5 cuvette a [C] note. Chiudiamo il "vano" con l'apposito vetro e facciamo partire l'analisi. Lo spettrofotometro sottoporrà al fascio di luce, una alla volta, tutte le cuvette facendole girare come in una catena di montaggio.

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Prendiamo i valori che compaiono sul display e annotiamoli su un foglio. A questo punto costruiamo una retta di taratura. Mettiamo sull'asse x le concentrazioni note e sull'y, i valori dell'A (assorbanza) appena calcolata. Otteniamo cosi una retta. Ora possiamo prendere la cuvetta con la concentrazione incognita di DNA, la mettiamo nello spettrofotomentro e vediamo l'assorbanza misurata dallo strumento.

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Riportiamo questo valore sull'asse delle ordinate e, conoscendo il valore dell'asse y (assorbanza) posso conoscere il corrispettivo valore sull'asse delle ascisse. Partendo dall'ultimo valore trovato, tracciamo un segmento parallelo all'asse x fino alla retta. Continuiamo col disegnare un altro segmento (con un angolazione di 90 gradi) che, partendo dall'intersezione "retta-segmento", continui fino all'asse x. L'intersezione con questo ultimo asse fornisce la concentrazione di DNA.

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Quindi seguendo i pochi e semplici passaggi riportati all'interno di questa guida, sapremo finalmente come fare per riuscire ad eseguire correttamente il dosaggio del DNA utilizzando il metodo colorimetrico. Per chi è alle prime armi con questo tipo di operazioni, potrà trovare i passaggi precedenti leggermente complicati, tuttavia con un po' di pazienza e provando varie volte, riusciremo alla fine ad ottenere un risultato perfetto. A questo punto non ci resta che leggere attentamente tutte le indicazioni riportate all'interno di questa guida, per potere subito provare ad eseguire questo calcolo. Inizialmente potremo trovare qualche difficoltà ma con un po' di pratica riusciremo ad eseguire tutte le operazioni in maniera rapida e corretta.

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Consigli

Non dimenticare mai:
  • Dal grafico dell'immagine si capisce in che modo si opera l'estrapolazione
  • é detto colorimetrico perchè solo grazie al colorante riesco a separare il Dna da tutto il resto
  • Attraverso una semplice misura spettroscopica (di assorbanza) posso trovare la concentrazione in modo estremamente rapido

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