Come Trasferire Le Proteine Dal Gel Alla Membrana Di Nitrocellulosa

tramite: O2O
Difficoltà: media
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Introduzione

Il western blot è una tecnica biochimica che permette di identificare una determinata proteina in una miscela di proteine, mediante il riconoscimento da parte di anticorpi specifici. Nello specifico, per facilitare il riconoscimento, la miscela di proteine viene prima separata in base alle loro dimensioni (o peso molecolare) utilizzando un gel di poliacrilammide, successivamente le proteine vengono trasferite su di un supporto, per meglio dire in una membrana di nitrocellulosa, e quindi si procede al riconoscimento vero e proprio della proteina, mediante l'utilizzo di un anticorpo specifico. Da recenti studi, sono state messe a punto tecniche che permettono il riconoscimento antigene/anticorpo direttamente nella matrice del gel, evitando quindi il trasferimento su membrana. Continuando nella lettura di questo articolo vi saranno fornite delle utili informazioni su come trasferire le proteine dal gel alla membrana di nitrocellulosa.

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Occorrente

  • carta assorbente per western
  • membrana di nitrocellulosa
  • gel
  • tampone di trasferimento
  • apparato ad immersione
  • spugnette
  • gabbiette
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Generalmente questa tecnica trova applicazione quando il campione è composto da una miscela di moltissime proteine tali che, con una colorazione standard (blu di Kumasi o nitrato di argento) non si riuscirebbe a distinguerle l'una dall'altra oppure quando, pur avendo bande ben distinte, la proteina in questione è in quantità troppo basse per essere visualizzata con altre tecniche.

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Il momento in cui, mediante elettroforesi su gel di acrilammide, si saranno separare le proteine sul gel stesso, è consigliabile prendere i vetrini contenenti il gel e bagnarli in acqua deionizzata prima di aprirli, per evitare che essendo caldi, si possano rompere nella manovra o ancor peggio, possano recare danni al gel. È buona norma utilizzare sempre i guanti, in quanto si lavora con acrilammide, la quale è una potente neurotossina. Mettete i vetrini in un contenitore con un po' di quest'acqua deionizzata e apriteli delicatamente; vi accorgerete che il gel rimane adesso ad uno dei due. Ora si avranno a disposizione le gabbiette in cui avverrà il trasferimento e, le rispettive spugnette.

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A questo punto, procuratevi 4 fogli di carta assorbente per western della grandezza e della forma delle spugnette (ritagliate ad esempio 4 quadrati della grandezza di 10 cm X 10 cm se corrisponde) per ogni gabbietta che utilizzerete (la gabbietta di solito va bene per un singolo gel). Inoltre dovrete preparare il tampone di trasferimento, ovvero il liquido in cui queste gabbiette dovranno essere immerse. Prendete il tampone Tris-Glicina al 10 X che tenete in laboratorio e misurate 100 ml in un cilindro da 1 L. Poi aggiungete 700 ml di Acqua Sterile e 200 ml di Metanolo. Versate il litro di tampone di trasferimento nell'apparato ad immersione e intanto chiudete.

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Adesso, prendete la gabbietta, apritela e bagnatela con del tampone di trasferimento avanzato da un precedente Blotting. Tenere la gabbietta con le spugnette in umido nel tampone, per evitare che si formino bolle di aria mentre fate aderire le varie componenti del "sandwich di trasferimento" che state per preparare. Ora bagnate la carta assorbente nel tampone nel quale tenete in umido la gabbietta. Ponete due fogli di questa carta su una delle spugnette, posta su uno dei lati della gabbietta aperta. Dopodiché lasciate aderire su questa carta assorbente la membrana di nitrocellulosa priva del film protettivo che toglierete proprio in quel momento. Ricordate che la membrana deve essere esposta all'aria il meno possibile perché potrebbe facilmente attrarre delle impurità.

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Nel momento in cui la membrana è nella carta assorbente bagnata, prendete il gel staccandolo delicatamente dal vetrino e, ponetelo sulla membrana di nitrocellulosa, prestando molta attenzione a che non si formino delle bolle d'aria tra il gel e la membrana. In caso si formassero, schiacciate molto delicatamente il gel finché le bolle d'aria non scivoleranno lateralmente. Successivamente lasciate aderire sopra il gel gli altri due fogli di carta assorbente, la spugnetta e chiudete la gabbietta.

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