Come Saggiare La Sopravvivenza Cellulare In Colture Cellulari

tramite: O2O
Difficoltà: media
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Introduzione

La biologia è senza dubbio una delle materie più belle e affascinanti che si possa studiare. Tramite il suo studio possiamo comprendere meglio come si sviluppa la vita dalle sue parti più elementari. Ovviamente la biologia ha una vasta gamma di argomenti ed un programma molto vario, va dallo studio delle cellule fino allo studio degli animali più grandi. E proprio di microbiologia che tratterà la guida che andrete a leggere e in particolar modo su come saggiare la sopravvivenza cellulare in colture cellulari.

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Occorrente

  • TdT e nucleotidi fluoresceinati
  • Microscopio a fluorescenza
  • Spettrofotometro
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Le colture cellulari consistono nello studiare il comportamento delle cellule al di fuori dall'organismo da cui derivano ma in condizioni artificiali che cercano di riprodurre il più possibile le condizioni naturali. L'utilità delle colture sta nello sperimentare sulle cellule gli effetti di farmaci o cure contro malattie più o meno gravi.

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Un saggio importantissimo e molto affidabile che puoi utilizzare è il saggio Tunel. Le cellule vengono trattate con un enzima che si chiama TdT (terminal deoxynucleotide transferase) più nucleotidi fluoresceinati. Questo enzima aggiunge i nucleotidi al DNA frammentato; ciò significa che se le cellule sono in apoptosi o in tarda necrosi possono essere identificate a microscopio a fluorescenza in quanto al DNA frammentato sono stati aggiunti nucleotidi che emettono fluorescenza. Come nella prima foto siano evidenziati tutti i nuclei mediante il colorante Hoechst, nella seconda foto puoi invece osservare le cellule Tunel-positive dopo il saggio e la terza è un merged delle due fluorescenze che ti consente di capire che quei nuclei positivi per Hoechst e Tunel sono nuclei di cellule in apoptosi o necrosi.

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Sicuramente uno dei saggi più utilizzati è quello della Lattato Deidrogenasi. Questo enzima è presente all'interno delle cellule e quando queste muoiono, o vanno incontro ad apoptosi, si riversa all'esterno della cellula stessa evidenziando un aumento della sua attività a livello extracellulare. Pertanto il rapporto tra l'attività della LDH (lattato deidrogenasi) extracellulare su quello della LDH intracellulare aumenta. Tramite osservazioni è possibile dedurre anche l'aumento della Lattato Deidrogenasi. Innanzitutto è doveroso sapere che la LDH incamera Piruvato ed NADH e libera Lattato e NAD. Quest'ultimo è una molecola con uno specifico spettro d'assorbimento, per cui lo spettrofotometro ci permetterà di risalire alla sua concentrazione, come anche all'attività della lattato diidrogenasi. Dunque se lo spettrofotometro ci dice che il NAD extracellulare è aumentato vuol dire che le cellule stanno soffrendo/morendo.

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