Come ricavare la concentrazione di una soluzione da misure spettrofotometriche

Una tecnica analitica largamente utilizzata sfrutta il fenomeno dell'assorbimento delle radiazioni elettromagnetiche da parte delle soluzioni. Nello specifico prende il nome di spettrofotometria oppure fotometria, a seconda delle condizioni sperimentali e strumentali di misura. Questo genere di analisi torna particolarmente utile nella determinazione di quantità estremamente piccole, laddove la maggior parte dei metodi analitici si rivelano essere imprecisi se non addirittura inadeguati. In questa semplice ed esauriente guida, passo dopo passo, vi forniremo tutte le principali indicazioni su come è possibile ricavare la concentrazione di una soluzione da misure spettrofotometriche nel migliore dei modi. Questo tipo di procedura può essere appreso senza particolari problemi, anche se necessita di un po' di tempo, nonché di un costante esercizio.

Quando una soluzione è colpita da una radiazione (come avviene in uno spettrofotometro), una parte di questa radiazione viene assorbita dalla soluzione stessa, la restante parte viene invece riemessa, o meglio, attraversa la soluzione senza essere assorbita. Si dice che viene trasmessa. L'entità dell'assorbimento è strettamente collegata alla concentrazione ed allo spessore della soluzione attraversata. Ciascuna sostanza, pertanto, ha una sua caratteristica "carta d'identità", che tecnicamente è definita spettro di assorbimento, secondo la quale è in grado di assorbire maggiormente una radiazione piuttosto che un'altra. Ogni sostanza avrà quindi, all'interno di tutto lo spettro elettromagnetico, delle frequenze di assorbimento preferenziali.

Indicando con I0 l'intensità del raggio incidente (il raggio che colpisce la sostanza) e con I l'intensità del raggio trasmesso da uno spessore "d" di una determinata soluzione con concentrazione "c", si definisce la trasmittanza il rapporto T = I0 / I. Se calcoliamo il logaritmo negativo della trasmittanza, ricaviamo l'assorbanza "A", detta anche estinzione oppure densità ottica. L'assorbanza è direttamente proporzionale al prodotto tra lo spessore della soluzione attraversata e la concentrazione e deriva dal dal calcolo matematico: A = - log T = Log I/ I0 = e · d · c. Nella formula, e è definito coefficiente di estinzione molare e dipende dal tipo di soluzione": ha valore 40 per l'RNA, 50 per il DNA e così via. "d" è lo spessore della soluzione, definito come cammino ottico (banalmente viene imposto dal "contenitore" in cui si trova la soluzione) e c è la concentrazione della soluzione stessa. Questa formula rappresenta la legge di Lambert Beer, che governa l'assorbimento di ciascun genere di radiazione elettromagnetica e consente di calcolare la concentrazione delle soluzioni da misure di assorbanza. Nella maggior parte degli strumenti adoperati per le misure di assorbanza, il cammino ottico è, per convenzione, stabilito a 1cm (nei più moderni strumenti si è scesi anche a 1mm, permettendo di valutare l'assorbanza di volumi anche molto piccoli di campione). Con questi parametri, la legge di Lambert Beer è valida in un range che va da 0 a 1. Per valori di assorbanza superiori a 1, si perde la linearità e il dato ottenuto non è più attendibile.

Supponiamo, a questo punto, di avere una soluzione che presenti un coefficiente di estinzione molare, ad una determinata lunghezza d'onda, pari a 260. Inoltre, consideriamo che ci sia una trasmittanza di 0,55 con 2 centimetri di soluzione. Per determinare la concentrazione in moli/litro (ovvero la molarità) della soluzione, si deve fare riferimento alla legge di Lambert Beer. Pertanto occorre ricavare, da quest'ultima, quella che è la formula inversa per calcolare la concentrazione. A questo punto, avremo: c = - log T /(d · e). Il prossimo procedimento consiste nell'inserire, nella formula medesima, i corrispondenti valori numerici: c = - log 0,55 /(2 · 260). Quindi, non rimane altro da fare che svolgere il calcolo appena citato e troveremo che la concentrazione della soluzione è pari a 0,0005 moli/litro.

Passiamo ora alla pratica vera e propria! Sperimentalmente, i metodi più comuni per determinare la concentrazione di una soluzione prevedono l'uso di standard a concentrazioni note, che permettono la costruzione di una retta di taratura. Generalmente si utilizzano standard di BSA (albumina di siero bovino), preparati a determinate concentrazioni, mediante diluizioni seriali. Ad ogni standard corrisponderà un valore di assorbanza, che è direttamente proporzionale alla concentrazione dello standard stesso. Pertanto, potremo riportare i valori di assorbanza su un grafico, in funzione della concentrazione. Otterremo dei punti che ci permetteranno di tracciare una retta: la retta migliore sarà quella che permette di unire tutti i punti presenti sul nostro grafico (o per lo meno ci passa vicino). Questa retta è la retta di taratura e avrà una funzione pari a y=m+ax, dove y è l'assorbanza e x è la concentrazione. Possiamo a questo punto determinare la concentrazione dei nostri campioni tramite un semplice misura spettrofotometrica. Avremo un valore di assorbanza che, inserito nell'equazione della retta, ci permetterà di ottenere il valore della concentrazione, che sarà quindi uguale a x=(y-m)/a.

Per la quantificazione di alcuni particolari tipi di campione, come i campioni proteici, che non assorbono nel visibile, è necessario ricorrere a metodi colorimetrici. Questi metodi si basano sull'utilizzo di un colorante, che lega le proteine e, nella sua forma legata, presenta assorbimento ad una data lunghezza d'onda. L'assorbanza è in genere direttamente proporzionale al quantitativo proteico. Tra i metodi colorimetrici maggiormente utilizzati troviamo il metodo Bradford, che si basa sulla capacità del colorante Comassie brilliant Blue G di legare le proteine. Nella sua forma legata assorbe a 595nm e possiamo quindi leggerne l'assorbanza. Il metodo del biureto prevede l'aggiunta di una soluzione rameica, che assume un colore porpora e ha un picco di assorbimento a 540nm. Il metodo dell'acido bicinconinico è simile al metodo del biureto e si basa sulla capacità delle proteine di ridurre il rame (III) a rame (II), generando un composto che assorbe a 562nm. Questi metodi sono tutti di tipo indiretto e si basano sulla costruzione di una retta di taratura. In alternativa si può procedere con quantificazioni di tipo diretto, leggendo il campione direttamente allo spettrofotometro senza colorarlo. In tal caso, ad esempio, leggeremo il DNA a 230nm, l'RNA a 260nm e le proteine a 280nm.

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