Come Preparare Le Piastre Per La Semina Batterica

tramite: O2O
Difficoltà: media
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Introduzione

In campo biologico, replicare le cellule batteriche comporta grandi vantaggi. Ad esempio, trasformando un ceppo batterico si potranno isolare selettivamente i batteri con il plasmide da quelli senza. Inoltre, si possono distinguere quei batteri con il plasmide ricombinante. Lavorare con le cellule spesso si rivela una procedura complessa. La contaminazione è infatti sempre dietro l'angolo. A tale scopo, in questo tutorial, vedremo come preparare correttamente le piastre per la semina batterica.

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Occorrente

  • piastra Petri sterile
  • 25 µL di un opportuno antibiotico
  • 25 µL di IPTG
  • 50 µL di X-GAL
  • 25 mL di terreno LB agarizazto
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Per preparare le piastre per la semina batterica, lavora preferibilmente sotto cappa o vicino ad un becco bunsen. Prendi una piastra Petri sterile e in gocce separate poni 25 µL di un opportuno antibiotico (100 µg/ mL) e 25 µL di IPTG (0.5M). L'antibiotico ti permette di selezionare le cellule trasformate, ovvero con il plasmide. Devi poi mettere l'IPTG per discriminare i ceppi ricombinanti mediante saggio colorimetrico bianco-blu, IPTG - X-GAL. In base all'esperimento sceglierai in seguito le varianti e gli strumenti più adatti.

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A questo punto, versa nella piastra per la semina batterica circa 25 mL di terreno LB agarizzato. Unisci il terreno ancora liquido, a temperatura adeguata. Se troppo freddo, infatti, non si miscelerebbe con l'antibiotico e l'IPTG. Diversamente, se troppo caldo inattiverebbe l'antibiotico. Per impedire la contaminazione del terreno, flamba sempre il coperchio ed il collo della bottiglia dove conservi il terreno. Queste piccole accortezze possono essere davvero vitali per la buona riuscita della semina batterica. Aggiungi quindi 50 µL di X-GAL (20 mg/mL) al terreno ancora liquido e ruota immediatamente la piastra per distribuire uniformemente i tre composti. L'X-GAL riconosce le colonie ricombinanti. L'IPTG induce il promotore del gene lac-Z il cui prodotto distingue le colonie ricombinanti di colore bianco, dalle colonie non ricombinanti di colore blu.

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Lascia solidificare la piastra aperta sotto cappa. Dopo la solidificazione, piastra le cellule distribuendole uniformemente sulla superficie del terreno. Aiutati con un'ansa sterile. In alternativa, utilizza una pipetta Pasteur di vetro e riscaldane le estremità su un becco bunsen. Otterrai così una sorta di spatolina. Attenzione affinché non sia troppo calda, altrimenti potrebbe uccidere le cellule per la semina batterica. Pertanto, incuba per tutta la notte a 37° C e capovolgi le piastre per impedire la condensa. L'esperimento è pronto per lo studio.

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Consigli

Non dimenticare mai:
  • Crea sempre l'ambiente più propizio per la proliferazione delle colonie
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