Come preparare cellule competenti con cloruro di calcio

Tramite: O2O
Difficoltà: media
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Introduzione

Rendere una cellula batterica competente significa rendere la sua membrana permeabile al fine di permettere l'ingresso di molecole di DNA al suo interno. È un metodo abbastanza semplice, ripetibile e che offre un'efficienza di trasformazione molto elevata. In questa guida, quindi, vedremo come fare per riuscire a preparare correttamente cellule competenti utilizzando il cloruro di calcio.

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Occorrente

  • Ceppo batterico
  • Terreno liquido LB
  • Beuta da 1 l
  • Provette da 15 mL
  • CaCl2
  • Ghiaccio
  • Centrifuga
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In primis dobbiamo procedere con un pre-inoculo. Per farlo isoliamo una colonia cellulare e inoculiamola in 5 mL di terreno liquido LB, incuba a 37°C overnight (16-20 ore massimo). Facciamo molta attenzione alla sterilità, in questa fase non adoperiamo mai colonie più vecchie di 3-4 settimane. Questa fase di pre-inoculo ci servirà ad evitare lo sviluppo di contaminanti e ci permetterà di raggiungere rapidamente il plateau della curva di crescita batterica.

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Il giorno dopo trasferiamo in una beuta della capacità di 1 L, 200 µL 1 mL del pre-inoculo in 100 mL di LB, incuba per 3 ore a 37°C. È consigliato incubare in continua agitazione per favorire una migliore ossigenazione e quindi una rapida crescita batterica, per questo dovremo utilizzare beute di grande volume per favorire un'adeguata areazione del mezzo. Controlliamo che la OD 600 sia tra lo 0.2 e 0.3. Per farlo dovremo in realtà prelevare la cellule nel punto di massima attività metabolica che corrisponde ad una OD di circa 0.1, ma è consigliato prelevare ad una OD tra 0.2-0.3 perché così avremo una maggiore quantità di cellule trasformate.

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In un ambiente assolutamente sterile, trasferiamo 15 mL di sospensione batterica in una provetta. Per bloccare poi la crescita batterica, manteniamo la sospensione in ghiaccio per 10 minuti. Centrifughiamo a 2000 g per 10 minuti a 4°C. Non adoperiamo la massima velocità di centrifuga altrimenti le cellule si stressano troppo. Eliminiamo il terreno di coltura (il surnatante) e poniamo immediatamente le cellule in ghiaccio.

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Per eliminare il surnatante, versiamolo delicatamente facendo attenzione a non staccare il pellet dal fondo. Sospendiamo il pellet in 10 mL di CaCl2 100 mM raffreddato in ghiaccio e lasciamo le cellule in ghiaccio per 10 minuti. Adoperiamo un CaCl2 sterile, autoclavato o sterilizzato per filtrazione.

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Sospendiamo completamente e velocemente dando dei piccoli colpetti col dito sulla provetta. Centrifuga a 2000 g per 10 minuti ed eliminiamo il surnatante. Facciamo sempre molta attenzione a non arrecare disturbo al pellet che si è formato. Sospendiamo ora il pellet in 0.6 mL di CaCl2 100 mM freddo per ogni 15 mL di coltura inizialmente usata. Manteniamo le cellule per 1 ora in ghiaccio, la durata di questa fase sarà poi determinate per la trasformazione.

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Quindi seguendo i pochi e semplici passaggi riportati all'interno di questa guida, sapremo finalmente come fare per riuscire a preparare correttamente cellule competenti utilizzando il cloruro di calcio. Per chi è alle prime armi con questo tipo di lavori, potrà trovare i passaggi precedenti leggermente complicati, tuttavia con un po' di pazienza e provando varie volte, riusciremo alla fine ad ottenere un risultato perfetto. A questo punto non ci resta che leggere attentamente tutte le indicazioni riportate all'interno di questa guida, per poter subito provare a preparare le cellule.

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Consigli

Non dimenticare mai:
  • Lavora sempre in ghiaccio
  • Attenzione alla sterilità
Alcuni link che potrebbero esserti utili:

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