Come funziona la cromatografia su colonna

Al fine di potere studiare le proprietà strutturali e funzionali di una proteina, il primo passo da compiere è quello di ottenerla in forma pura. A tale scopo, ci si può avvalere di numerose tecniche alcune delle quali risultano più efficaci rispetto ad altre. I metodi classici sfruttano le proprietà che differenziano una proteina dall'altra, tra cui le proprietà di legame, la grandezza e la carica. Uno dei metodi maggiormente sfruttati per la separazione delle proteine, è la cromatografia su colonna.
La cromatografia su colonna è una delle tecniche Cromatografiche maggiormente usate, sfrutta il fatto che certe sostanze una volta sciolte in specifici solventi si fissano su materiali inerti.
Nello specifico i siti attivi di un materiale inerte, (spesso viene usato il silice), interagiscono con i gruppi funzionali delle molecole del soluto che voglio separare, le molecole del soluto si legano alla sostanza ma in maniera reversibile (fase stazionaria) attraverso delle interazioni dette dipolo-dipolo .

In questa breve guida, illustreremo come funziona nei minimi dettagli questa tecnica e come applicarla nel modo più consono possibile. Si tratta di una procedura che a primo impatto potrà sembrare complessa ma che in realtà è di facile comprensione e svolgimento.

• Colonna di vetro
• Sostanze da separare
• Materiale assorbente
• Becher

Gli elementi standard utilizzati per eseguire la cromatografia su colonna, includono un materiale poroso e solido che prende il nome di matrice. Con tale materiale, si riempie la colonna che generalmente si presenta di vetro o di plastica. Una soluzione, che rappresenta la fase mobile(stazionaria), viene fatta fluire attraverso la matrice e la soluzione che si ricava fuoriuscendo dalla parte bassa della colonna viene continuamente rimpiazzata da una soluzione contenuta in un recipiente di riserva posto in cima alla colonna.

Per cominciare bisogna pesare la silice (fase stazionaria), avremo bisogno di silica gel e ovviamente di una bilancia, basterà riempire un becker della quantità di silice di cui ho bisogno.

Preparo la fase mobile composta da diclorometano e metanolo in rapporto 8 a 2, a questo punto mischio fase stazionaria e mobile per ottenere un così detto slurry che userò nella fase successiva per l'impaccamento della colonna.

Mescoliamo lo slurry per qualche minuto fino ad ottenre un risultato omogeneo, successivamente possiamo versare lo slurry nella colonna (ricordandoci di tenere il ribinetto della colonna sempre aperto).
Per facilitare l'mpaccamento della colonna possiamo dare dei piccoli colpetti ovviamente stando molto attenti a non esercitare troppa forza, ora chiudiamo il rubinetto e aspettiamo che la fase stazionaria e la fase mobile siano a livello.

Prima di passare al caricamento della misclea una volta a livello inseriamo un dischetto di carta da filtro, per evitare di intaccare la fase stazionaria.

La miscela deve essere disciolta della minima quantità di solvente possibile, la soluzione proteica che inseriamo nella colonna (questa volta riapriamo il rubinetto), andrà a formare una banda più o meno spessa di proteine. Queste ultime, sottoposte alla forza di gravità, tenderanno inevitabilmente a scendere lungo la colonna, ma non tutte interagiscono con la matrice allo stesso modo. In questo modo le proteine con caratteristiche diverse tenderanno a separarsi le une dalle altre formando varie aggregazioni sulla colonnina, che ai nostri occhi appariranno come striscioline più o meno scure. Quest'ultimo rappresenta la fase essenziale del lavoro che ci accingiamo a compiere.

La procedura che ci impegniamo ad eseguire, migliora se si aumenta la lunghezza della colonna, ma anche le singole bande si allargano con il tempo e questo avviene per effetto della diffusione delle molecole con un processo che diminuisce la risoluzione. Potremmo avere dei problemi di separazione proteica con bande che si trovano troppo vicine e che col passare del tempo finirebbero inevitabilmente per riunirsi nuovamente annullando il lavoro svolto in precedenza. Nonostante tutt'e questa difficoltà sulla procedura, la cromatografia su colonna resta uno dei metodi più utilizzate e validi, sia per la sua semplicità che per i bassi costi in termini economici.

Come avete potuto dedurre dalla lettura di questa breve guida, apprendere la funzionalità della cromatografia su colonna non è un impresa estremamente difficile. Per chi è poco esperto in questo campo, potrà trovare i primi passaggi leggermente complicati, tuttavia con un po' di pazienza e tenacia riprovando piu volte, raggiungerà lo scopo prefissato in breve tempo.

• schema della cromatografia
• tecniche cromatografiche

• Come realizzare una cromatografia su carta