Come Fare Un'Immunofluorescenza Indiretta

tramite: O2O
Difficoltà: media
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Introduzione

L'immunofluorescenza indiretta è una tecnica scientifica molto diffusa poiché permette di visualizzare perfettamente ed in maniera veloce una determinata proteina da ricercare in un campione di orgine biologica. L'immunofluorescenza indiretta si basa sul principio secondo il quale, mediante l'uso di anticorpi coniugati a fluorofori, si può scoprire una specifica proteina. Non funziona affatto come l'immunofluorescenza diretta: nel nostro caso si sfrutta un secondo anticorpo legato ad un cromoforo il quale lega al primo anticorpo. La tecnica più rapida è quella che sfrutta la modalità diretta, inoltre richiede un minor numero di lavaggi e possiede tempi di incubazione limitati.

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Prima di tutto dovete fissare il preparato con della paraformaldeide. La paraformaldeide permette di immobilizzare il tessuto o le cellule nel loro originario stato vitale. Quella in eccesso dev'essere, in seguito, lavata via con una soluzione fisiologica, il PBS dopodiché è consigliabile aggiungere della glicina che permette di mascherare tutti i legami aldeidici scoperti della para-formaldeide che ha immobilizzato il campione, evitando così che l'anticorpo che verrà aggiunto successivamente si leghi in modo aspecifico (con legami idrogeno, forza di Van der Waals) al tuo campione.

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Dopo opportuni lavaggi in PBS, dovrete procedere con il saturare per un'ora intera il vostro campione con il siero immune dell'animale dal quale il campione è stato prelevato (ad esempio topo) o BSA (Albumina sierica bovina) per mascherare tutti i siti aspecifici a cui eventualmente l'anticorpo potrebbe finire per legare irreversibilmente, rovinando del tutto i risultati. Dopo ulteriori lavaggi in PBS potrete incubare il campione con l'anticorpo primario, prodotto in una determinata specie, ad esempio coniglio (rabbit). Questo anticorpo, monoclonale, in media è più concentrato rispetto all'anticorpo secondario (c'è un rapporto 1:1 tra l'anticorpo primario e l'antigene della proteina di nostro interesse) e lo si lascia agire a 4 gradi OverNight.

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A questo punto potete pure incubare il campione con l'anticorpo secondario, prodotto in una specie diversa rispetto a quella nel quale è stato prodotto il primario -ad esempio capra-, e capace di riconoscerlo (es: goat anti-rabbit). Come anticipavo prima, solitamente il secondario può essere più diluito e la sua caratteristica è quella di avere coniugato un Fluoroforo, come la Rodamina che, se eccitata emette nel visibile del Rosso, dando dunque una Fluorescenza rossa. I tempi di incubazione del secondario variano in media da tre quarti d'ora a un'ora. Inseguito lavate al meglio via l'eccesso di anticorpo secondario con PBS e montate il vetrino.

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