Come Fare Un'Immunofluorescenza Indiretta

tramite: O2O
Difficoltà: media
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Introduzione

Le Facoltà universitarie che offrono materie davvero interessanti sono tante, quindi non mancano assolutamente possibilità di scelta. Tra gli argomenti preferiti rientrano sicuramente quelli di microbiologia. Queste nozioni vengono adorate dagli studenti appassionati di indagini sui microorganismi (batteri, miceti, virus e protozoi). Una metodologia scientifica abbastanza diffusa è l'immunofluorescenza, finalizzata alla rilevazione dell'esistenza di un anticorpo o antigene sconosciuto. La controparte disponibile al ricercatore si lega ad un colorante detto fluorocromo (quale ad esempio la fluorescina), che diffonde una radiazione luminosa grazie all'assorbimento degli ultravioletti. Si può distinguere tra immunofluorescenza diretta (contatto dell'antigene sconosciuto con il noto anticorpo marcato) ed immunofluorescenza indiretta (contatto dell'anticorpo o antigene ignoto rispettivamente con l'antigene o antisiero noto). Quest'ultima consente di visualizzare perfettamente e rapidamente una determinata proteina da ricercare in un campione d'origine biologica. L'immunofluorescenza diretta ha tempi di incubazione limitati e richiede un minor numero di lavaggi. Quest'ultimi permettono di conoscere se l'anticorpo, l'antigene o l'antisiero conosciuto risulta specifico per l'antigene o l'anticorpo incognito. L'immunofluorescenza indiretta si fonda sul principio secondo cui, tramite l'impiego di anticorpi coniugati a fluorocromo, è possibile scoprire una determinata proteina. Viene quindi sfruttato un secondo anticorpo legato ad un cromoforo, il quale lega al primo anticorpo. Nel presente tutorial sulla microbiologia vediamo brevemente dunque come fare un'immunofluorescenza indiretta.

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Occorrente

  • Conoscenze di microbiologia
  • Antigene o anticorpo o antisiero noto
  • Antigene o anticorpo ignoto
  • Glicina
  • Microscopio
  • Paraformaldeide
  • Tampone fosfato salino (PBS)
  • Siero immune di animale o sieroalbumina bovina
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Immobilizzare il preparato con la paraformaldeide ed aggiungere la glicina

Innanzitutto bisogna fissare il preparato attraverso della paraformaldeide. Quest'ultima consente di immobilizzare il tessuto o le cellule nel loro stato vitale originario. La paraformaldeide in eccesso dovrà venir poi rimossa tramite una soluzione fisiologica, ovvero il tampone fosfato salino (PBS). Dopodiché si consiglia di aggiungere glicina, la quale consente di mascherare tutti i legami aldeidici scoperti della paraformaldeide che ha immobilizzato il campione. Tale immobilizzazione evita che l'anticorpo successivamente aggiunto si leghi in modo atipico (legami idrogeno, forza di Van der Waals) al campione.

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Saturare il campione ed incubarlo con l'anticorpo primario

Terminato di eseguire i lavaggi in PBS necessari? Per 60 minuti interi, saturare il campione analizzato con il siero immune dell'animale dal quale venne prelevato (come un topo o criceto) o BSA (sieroalbumina bovina). In questo modo si possono mascherare tutti i siti non specifici ai quali l'anticorpo potrebbe eventualmente finire per legare irreversibilmente, distruggendo totalmente i risultati. Dopo ulteriori lavaggi in PBS, incubare il campione tramite l'anticorpo monoclonale primario prodotto in una determinata specie (come ad esempio il coniglio). Quest'ultimo risulta in media più concentrato rispetto all'anticorpo secondario, lasciandolo agire a 4°C OverNight.

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Incubare il campione con l'anticorpo secondario e montare il vetrino

Adesso si potrà anche incubare il campione tramite l'anticorpo secondario prodotto in una specie differente rispetto a quella in cui venne ricavato l'anticorpo primario e capace di riconoscerlo (come ad esempio la capra). L'anticorpo secondario può essere generalmente più diluito e la sua caratteristica è aver coniugato un fluorocromo quale la rodamina B. Se viene eccitata, tale molecola immette del rosso nel visibile, fornendo quindi una fluorescenza rossa. I tempi di incubazione dell'anticorpo secondario variano mediamente da 45 minuti fino ad 1 ora. Dopodiché occorre rimuovere completamente l'eccesso di anticorpo secondario con PBS e montare il vetrino. Ecco quindi spiegato come fare la immunofluorescenza indiretta.

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Consigli

Non dimenticare mai:
  • Assicurarsi che i vetrini siano perfettamente disinfettati e liberi da corpi estranei, come la polvere.
  • Immobilizzare il campione con la paraformaldeide prima di incubarlo.
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