Come fare un'elettroforesi su gel d'agarosio

Tramite: O2O 05/05/2018
Difficoltà: facile
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Introduzione

L'elettroforesi su gel d'agarosio rappresenta una particolare ed importante tecnica che vi permette di separare facilmente dei frammenti di DNA opportunamente amplificati mediante il metodo della PCR. A seconda della loro lunghezza i frammenti rimarranno intrappolati nelle maglie formate dall'agarosio, un polisaccaride ricavato specificatamente da un alga, la quale forma un gel. Con questa guida verrà precisamente illustrato come preparare il gel e come far separare correttamente i vostri campioni di DNA.

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Occorrente

  • agarosio
  • apparato per elettroforesi
  • bromuro di etidio
  • guanti
  • DNA amplificato da separare
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Preparazione del gel

Prima di tutto dovrete preparare il gel; la preparazione dipende da quanta concentrazione di Agarosio vi occorre per separare i frammenti di DNA amplificati con la PCR. Ad esempio, se dovete farlo all'1% aggiungete in una bottiglia 2 gr di agarosio in 200 mL di buffer TBE 0.5. Portate la bottiglia al microonde, portandola ad ebollizione. Aggiungete il Bromuro di Etidio e agitate bene, il gel è così pronto per essere versato. Dovrà essere versato da caldo, perché a temperatura ambiente l'agarosio solidifica. Montate l'apparecchio per elettroforesi, aggiungete i pettinini e versate il composto facendolo solidificare. Quindi, aggiungete il TBE 0.5 che dovrà servire come buffer di corsa. Prima di caricare i campioni di DNA dovrete aggiungere per ognuno di loro un colorante-addensante, il tampone di caricamento.

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Caricamento dei campioni

Caricate i campioni nei pozzetti con la pipetta gilson cambiandole sempre la punta quando passate da un campione all'altro, per non contaminare DNA diversi. Lasciate il primo pozzetto vuoto per caricare il marker. Caricate il marker, chiudete l'apparato da elettroforesi e imposta il voltaggio opportuno per quel tipo di apparato. Ricordate che i pozzetti dovranno essere verso il polo negativo dell'apparato, perché avendo il DNA carica negativa, i frammenti dovranno migrare verso il polo positivo per separarsi.
Quando vedrete che i campioni hanno corso abbastanza, spegnete l'apparato e visualizzate il gel in un opportuno dispositivo a raggi UV.

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Gelificazione dei polimeri

Durante la gelificazione, i polimeri di agarosio si associano non-covalentemente e formano una rete di pacchi, le cui dimensioni dei pori determinano le proprietà di setacciamento molecolare del gel. L'uso dell'elettroforesi su gel di agarosio ha rivoluzionato la separazione del DNA. Prima dell'adozione dei gel di agarosio, il DNA veniva principalmente separato mediante centrifugazione con gradiente di densità del saccarosio, che forniva solo un'approssimazione delle dimensioni. Per separare il DNA usando l'elettroforesi su gel di agarosio, il DNA viene caricato in pozzi pre-cast nel gel e viene applicata una corrente. La spina dorsale del fosfato della molecola di DNA e RNA è caricata negativamente, quindi quando collocati in un campo elettrico, i frammenti di DNA migreranno verso l'anodo caricato positivamente. Poiché il DNA ha un rapporto massa / carica uniforme. Il modello principale per il movimento del DNA attraverso un gel di agarosio è una "rettifica parziale", in cui il bordo anteriore avanza e trascina il resto della molecola.

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Visualizzazione delle molecole di DNA

La velocità di migrazione di una molecola di DNA attraverso un gel è determinata da quanto segue: dimensione della molecola di DNA, concentrazione di agarosio; conformazione del DNA, tensione applicata, presenza di bromuro di etidio, tipo di agarosio e tampone di elettroforesi. Dopo la separazione, le molecole di DNA possono essere visualizzate sotto luce UV con un colorante appropriato. Seguendo questo protocollo, gli studenti dovrebbero essere in grado di comprendere il meccanismo mediante il quale i frammenti di DNA siano separati all'interno di una matrice di gel. Comprendere come la conformazione della molecola di DNA determinerà la sua mobilità attraverso una matrice di gel 3. Identificare una soluzione di agarosio di concentrazione appropriata per le loro esigenze. Preparare un gel di agarosio per l'elettroforesi di campioni di DNA. Impostare l'apparecchio per elettroforesi su gel e l'alimentazione. Selezionare una tensione appropriata per la separazione dei frammenti di DNA. Comprendere il meccanismo con cui l'etidio bromuro consente la visualizzazione delle bande di DNA.

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Consigli

Non dimenticare mai:
  • Il bromuro di etidio è un mutageno e deve essere trattato come una sostanza chimica pericolosa (quindi indossare i guanti durante la manipolazione)
Alcuni link che potrebbero esserti utili:

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