Come fare un'elettroforesi orizzontale

Tramite: O2O 20/02/2017
Difficoltà: media
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Introduzione

L?elettroforesi è definita come la migrazione di particelle sotto l?influenza di un campo elettrico. La mobilità della particella dipende dalla forza elettrostatica netta che agisce sulla particella. Nell?elettroforesi su gel c?è un mezzo di supporto che agisce impedendo disturbi meccanici e di convenzione durante la migrazione e che serve da setaccio molecolare per separare le molecole, provviste della stessa carica, in base alle dimensioni. La matrice può essere costituita da poliacrilammide, agarosio o una miscela di questi. I gel di agarosio sono largamente impiegati per separare molecole di DNA di dimensioni maggiori di 100 bp, si ricorre ai gel di acrilammide quando serve una risoluzione maggiore per frammenti di DNA dip iccole dimensioni. L'elettroforesi orizzontale è fatta in gel di agarosio, dalla concentrazione di agarosio dipenderà la gamma dei frammenti che verranno separati. In questa guida, vi illustrerò i passi fondamentali e le note tecniche da eseguire per effettuare una elettroforesi orizzontale.

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Occorrente

  • Gel di agarosio
  • Tampone di corsa
  • Loading buffer
  • Cameretta elettroforetica
  • Generatore di corrente
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L?agarosio è un polisaccaride lineare purificato dall?agar-agar delle alghe rosse; è solubile in acqua bollente e quando la soluzione si raffredda si forma un gel a causa della formazione di legami idrogeno tra le catene polimeriche dell?agarosio. Il primo passaggio da fare è l'adeguata quantità tampone di corsa (TAE o TBE). Dovete usare lo stesso tampone e alla stessa concentrazione (di solito 1X) di quello usato per la polimerizzazione dell'agarosio. Tenete presente che se adoperate come tampone il TAE, questo perde capacità tamponante perché agli elettrodi si ha la separazione di cariche, se adoperate il TBE, invece, questo ha capacità tamponante superiore, è molto stabile quindi potete adoperarlo per lunghi periodi di corsa, ma considerate che col tempo tende a precipitare.

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Prima di caricare il campione nei pozzetti del gel, aggiungete al campione un colorante in modo tale che potrete seguire istante per istante l'andamento dell'elettroforesi. Adoperate un Loading buffer, che potrete fare con 0,25% di Blu di bromo fenolo 0,25% di Xilene e 40% di saccarosio in acqua. Vi consiglio, durante il caricamento dei campioni, di lasciare un pozzetto vuoto in cui metterete il marker. Il marker è costituito da una miscela di frammenti di DNA a grandezza nota. In questo modo, confrontando semplicemente il vostro campione con il marker, potete risalire più o meno alla lunghezza del vostro frammento.

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Può capitare che durante il caricamento dei campioni, questi possano sfuggire dal pozzetto. Vi suggerisco, quindi, di aggiungere un po' di glicerolo per rendere più pesante il tutto. Il principio dell'elettroforesi consiste nella migrazione di cariche negative verso l'anodo. Tenete presente che la separazione avviene quindi solo in base alle dimensioni, e quindi alla massa della molecola. Ovviamente, avrete una distanza di migrazione dal pozzetto maggiore per molecole piccole le quali saranno trattenute di meno dalle maglie polisaccaridi, che del gel, e viceversa una distanza minore per le molecole più grandi. Una volta che avrete assemblato la cameretta, dovete applicare una differenza di potenziale proporzionale alla distanza degli elettrodi.

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Utilizzate per i gel di agarosio, un voltaggio costante. Adoperate un voltaggio di circa 5V/cm, altrimenti rischiate di scaldare il tampone di corsa e quindi danneggiare le molecole. Per ovviare a ciò, vi consiglio comunque di usare un'abbondante quantitativo di tampone di corsa. Voglio comunque sottolinearvi che nel caso di voltaggio costante, l'amperaggio non deve essere un fattore limitante, potete posizionare il cursore dei Milliampere al massimo. Un altro parametro che dovete ben considerare è il tempo della corsa elettroforetica, che sarà direttamente proporzionale alla risoluzione che otterrete. Quando i campioni hanno raggiunto una soddisfacente distanza dal pozzetto, esponete il gel ai raggi UV. Potrete vedere delle bande fluorescenti grazie al Bromuro di Etidio, che avrete preventivamente sciolto nel gel.

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