Per denaturare il DNA stampo, è necessario andare ad ottimizzare due parametri, che andremo ora a citare. Uno di questi è dato dalla denaturazione del DNA, mentre l'altro consiste nel mantenimento dell'attività della Taq polimerasi. Riguardo alla denaturazione del DNA, possiamo dire che questa è necessaria, dal momento che il DNA si trova nella classica conformazione a doppia elica, in cui i filamenti sono mantenuti insieme da ponti a idrogeno. Si deve, pertanto, favorire l'apertura del doppio filamento in modo tale da consentire l'appaiamento o l'annealing del primer. Occorre portare, quindi, la soluzione contenente il DNA ad una temperatura che sta al di sopra rispetto a quella di fusione, compresa tra i 92 ed i 96 gradi centigradi.