Come fare una PCR

La PCR rappresenta l'importantissima reazione a catena della polimerasi, ovvero la tecnica messa a punto da Mullis e da tutti gli altri suoi collaboratori nel 1986. Questa metodologia consente, in buona sostanza, di produrre un gran numero di copie di una specifica sequenza di DNA da una miscela di questo acido nucleico, mediante un processo chiamato amplificazione. Ricordiamo a tutti che il DNA è l'acido desossiribonucleico o deossiribonucleico, che contiene le informazioni genetiche indispensabili per effettuare la sintesi proteiche e dell'RNA. La PCR consiste in uno degli strumenti più importanti della moderna biologia. Per tale ragione, andremo a vedere insieme, in questa semplice ma utilissima guida, come fare una PCR.

• DNA stampo
• Nucleotidi
• MgCl2
• Tampone di reazione
• Taq polimerasi
• Primers specifici
• Termociclatore

Il punto di inizio della PCR è ovviamente il DNA. La reazione prevede il succedersi ciclico della denaturazione della doppia elica del DNA stampo, dell'appaiamento dei primers all'estremità del frammento di DNA ad essi complementare, e dell'estensione dei primers in direzione 5'-3' ad opera dell'enzima Taq DNA polimerasi. A ciascun ciclo il numero di copie della propria sequenza bersaglio aumenta in maniera esponenziale fino al raggiungimento di un plateau.

Per denaturare il DNA stampo, è necessario andare ad ottimizzare due parametri, che andremo ora a citare. Uno di questi è dato dalla denaturazione del DNA, mentre l'altro consiste nel mantenimento dell'attività della Taq polimerasi. Riguardo alla denaturazione del DNA, possiamo dire che questa è necessaria, dal momento che il DNA si trova nella classica conformazione a doppia elica, in cui i filamenti sono mantenuti insieme da ponti a idrogeno. Si deve, pertanto, favorire l'apertura del doppio filamento in modo tale da consentire l'appaiamento o l'annealing del primer. Occorre portare, quindi, la soluzione contenente il DNA ad una temperatura che sta al di sopra rispetto a quella di fusione, compresa tra i 92 ed i 96 gradi centigradi.

Riguardo l'attività della Taq polimerasi, possiamo stabilire che essa presenta un'emivita di circa 30 minuti alla temperatura di 95 gradi centigradi. Questo, naturalmente, può costituire un limite nel numero di cicli e nel tempo di denaturazione. Conviene, pertanto, cercare di diminuire il tempo di denaturazione a circa 35 secondi, in modo tale da aumentare il numero di cicli fino ad un massimo di 40-45. Si dovrà, successivamente, andare a programmare il tempo e la temperatura di appaiamento del primer a seconda del contenuto in G C.

Nel terzo procedimento si dovrà programmare la temperatura ed il tempo di estensione dei primers. La temperatura che occorre utilizzare è generalmente compresa tra i 68 ed i 72 gradi centigradi. La Taq presenta, infatti, il massimo di attività a 70 gradi centigradi. Se si considera che l'estensione dei primers avviene ad una velocità di circa 100 basi al secondo, in un minuto si riuscirà ad amplificare dei frammenti di circa 1 kbp. Il nostro consiglio, pertanto, è quello di tarare il tempo di estensione sulla lunghezza dello stampo da amplificare.

Inizialmente il nostro consiglio è quello di utilizzare un tampone di reazione privo di MgCl2, per poi aggiungere il sale separatamente. La quantità di ioni, infatti, costituisce un aiuto importante per l'attività della Taq polimerasi nel caricare i nucleotidi. Tuttavia influenza anche l'appaiamento dei primers allo stampo. Si deve tenere fortemente in considerazione che maggiore è la concentrazione di MgCl2, minore sarà la specificità della reazione chimica. Quando si mettono a punto, quindi, le condizioni di stringenza della propria reazione di PCR, occorre tenere in forte considerazione la concentrazione di MgCl2 e la temperatura di annealing.

Un altro parametro fondamentale da tenere in considerazione è rappresentato dal numero di cicli di amplificazione, che obbligatoriamente dipende dalla concentrazione di DNA di partenza. Non si deve mai, tuttavia, eccedere i 45 cicli. È comunque necessario un termociclatore, per poter settare il numero di cicli e l'appropriata temperatura. Sperando di esser stati di aiuto con queste nozioni basilari riguardanti la PCR, non ci resta che augurarvi buon lavoro.