Come Fare Una Marcatura Indiretta Con Perossidasi/anti-perossidasi

Tramite: O2O 26/12/2014
Difficoltà: difficile
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Introduzione

La marcatura indiretta prevede l'utilizzo di un anticorpo primario diretto contro una proteina di interesse, presente in un campione biologico di un anticorpo secondario, che lega il primario in un metodo di rilevazione correlato all'anticorpo secondario. Nel caso si abbiano piccole quantità di proteina di interesse c'è bisogno di un metodo di amplificazione del segnale: in questo caso l'anticorpo secondario sarà nudo e sarà riconosciuto da un anticorpo anti-perossidasi legato all'enzima perossidasi, che agirà su una molecola specifica al fine di migliorare la rilevazione. Nei passi della guida a seguire sarà illustrato dettagliatamente come fare una marcatura indiretta con perossidasi/ anti-perossidasi.

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Gli autoanticorpi tiroidei (o, più semplicemente, anticorpi anti-tiroide) sono anticorpi specifici per uno o più componenti della tiroide. Quelli più importanti dal punto di vista clinico sono: gli anticorpi anti-tireoperossidasi (anti-TPO o TPOAb), gli anticorpi anti-recettore della tireotropina (TRAb) e gli anti-tireoglobulina. La perossidasi tiroidea (TPO) è un enzima che normalmente si trova nella tiroide, dove svolge un ruolo importante nella produzione degli ormoni tiroidei; un test anti-TPO rileva la presenza nel sangue di anticorpi diretti contro questo enzima. La marcatura indiretta prevede l'utilizzo di un anticorpo primario che sia stato prodotto in una determinata specie e che sia capace di riconoscere la proteina di nostro interesse. Dopodichè va aggiunto il secondario, prodotto in una specie differente rispetto a quella in cui è stato prodotto il primario e capace di riconoscerlo. Questa metodica prevede l'utilizzo di un secondario che deve essere nudo ovvero non complessato a molecole di rilevazione, in quanto deve essere riconosciuto da un terzo anticorpo.

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Se l?esame dà un risultato negativo, gli autoanticorpi non sono presenti nel sangue in quel momento: questo esito può indicare che i sintomi sono da imputare a cause di natura non autoimmune. Tuttavia una certa percentuale dei pazienti che soffrono di patologie autoimmuni della tiroide non ha gli autoanticorpi, quindi se si sospetta che gli autoanticorpi si possano sviluppare in futuro, come può succedere nel caso di alcune patologie autoimmuni, si può ripetere l?esame in un secondo momento.

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A questo punto bisogna aggiungere il substrato su cui la perossidasi deve agire: questo è la DAB (3,3-diaminobenzidina) che, sotto l'azione dell'enzima precipita in un composto colorato marrone, a livello della proteina di nostro interesse. Ci sono da precisare due cose: la prima è che prima di avviare questa metodica bisogna bloccare con soluzione di acqua ossigenata la perossidasi endogena, per evitare falsi positivi. La seconda è che il campione, dopo essere stato incubato con la perossidasi e la DAB dovrà subire dei lavaggi in alcool a concentrazioni sempre maggiori perché il composto precipitato è insolubile in alcool; per cui più alcool c'è e più risulta scuro e quindi di facile rilevazione.

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