Come fare un western blot

Tramite: O2O 27/02/2017
Difficoltà: media
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Introduzione

Il "western blot", conosciuto anche come processo di immunorivelazione, è una tecnica immunochimica mediante la quale è possibile eseguire l'identificazione della presenza di determinate proteine all'interno di una miscela; questa verifica avviene tramite il riconoscimento di anticorpi specifici. Vediamo allora, attraverso i passi della seguente guida come fare un western blot.

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Innanzitutto dovrai controllare che le tue proteine si siano trasferite correttamente. A tal proposito, il marker sul filtro non è in grado di fornire delle informazioni utili, poiché possono essersi formate delle bolle tra il gel e la membrana che non permettono ad alcune proteine di trasferirsi. Versa circa 20 ml di soluzione di Rosso Ponceau nella vaschetta messa su un agitatore oscillante per 5 minuti; drena il colorante e decolora con acqua distillata fino a quando non siano visibili le bande. Il colorante può essere riusato per un centinaio di volte. Questo passaggio serve per valutare l'efficienza del trasferimento e rilevare la presenza di bolle. Tali informazioni sono tutte utili per tagliare la membrana e ridefinire l'area utile.

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Lava via il Ponceau dai filtri su un apposito agitatore con TBS 1M più 0,02 per cento di Tween. Il Tween è un detergente, per cui lava meglio il filtro rispetto al TBS normale. Quando i filtri sono del tutto puliti satura la membrana per un'ora con latte per blotting, solitamente al 5% in TBS-Tween. Fatto ciò, cola il latte dal filtro e aggiungi il tuo anticorpo primario. Puoi anche farlo agire per 3-4 ore a temperatura ambiente (sull'agitatore) ma per essere sicuri di avere un blotting ottimale è meglio incubarlo Over Nignt su un agitatore a 4 °C.

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Il giorno seguente elimina l'anticorpo primario con il TBS-Tween, effettuando un doppio lavaggi da 15 minuti ciascuno. Aggiungi poi l'anticorpo secondario, che normalmente è coniugato con la HRP; per cui, dopo un'ora di incubazione con il secondario, effettua un lavaggio con il TBS-Tween per 15 minuti e un successivo con il TBS normale per evitare che il Tween possa interagire con il substrato del reagente ECL che dovrai aggiungere in seguito. Lascia agire dunque l'ECL, solitamente per 5 minuti, dopodiché porta in camera oscura i filtri e sviluppali con delle apposite lastre fotografiche che ti consentiranno di visualizzare le proteine di tuo interesse grazie alla chemioluminescenza prodotta dall'ECL in base all'anticorpo secondario (HRP).

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