Come Fare Un Immunocitochimica Indiretta

Tramite: O2O 19/02/2017
Difficoltà: facile
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Introduzione

La reazione di immunocitochimica (ICC) permette di localizzare sostanze nelle cellule e nei tessuti mediante reazioni tra antigeni e anticorpi opportunamente marcati; grazie alle proprietà di determinati reagenti si formeranno prodotti di reazione colorati e visibili al microscopio ottico. Con questa tecnica ti illustrerò i passi fondamentali su come fare quella indiretta e alcuni accorgimenti da eseguire per ottenere un'ottima resa di reazione.

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Per prima cosa devi sparaffinare i vetrini. Poiché è possibile che l'anticorpo che adopererai non riesca a raggiungere l'antigene che cerchi, perché gli epitopi, cioè i siti di legame, sono bloccati da altre molecole, oppure nascosti dalla loro conformazione, devi procedere quindi con lo smascheramento antigenico. Se sai che la proteina che stai cercando ha i siti di legame bloccati da altre molecole, cerca di aumentare la permeabilità del campione all'anticorpo, adoperando dei detergenti come il triton X o soluzioni acide di HCl.

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Nel caso in cui la proteina che stai cercando ha i siti nascosti dalla sua struttura tridimensionale, puoi effettuare un trattamento termico, utilizzando delle soluzioni tampone come citrato 0,01 M pH 5. Puoi utilizzare un comune forno a microonde purché dotato di piatto girevole. Metti i preparati nelle vaschette portavetrino (non metalliche), e ricopri i vetrini con la soluzione tampone. Riscalda i vetrini con potenza compresa tra 350 W e 750 W in 1-4 cicli da 5 minuti (tempo totale 5-20minuti). Lascia raffreddare i vetrini a temperatura ambiente per 20 minuti, e poi lavali in PB a pH 7.4. In alternativa al forno al microonde puoi adoperare una stufa a bagnomaria a 95°C, anche in questo caso fai 5 cicli da 5 minuti ciascuno.

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Asciuga i vetrini con carta assorbente, prestando sempre molta attenzione a non intaccare l'integrità delle sezioni. Prepara una cameretta umida, dove metterai i vetrini a incubare negli step successivi. Puoi prendere semplicemente una scatola portavetrini e rivestirla di carta inumidita, lasciala sempre chiusa al fine di creare un ambiente sufficientemente umido. Cerchia le fette con la pap-pen, una penna idrofobca che ti permetterà di delimitare le sezioni. Questa operazione ti consentirà di circoscrivere l'area del preparato evitando la diffusione dei reagenti in aree vuote con risparmio sulla quantità di reagenti utilizzati. Ora procedi ad inibire gli enzimi endogeni. Infatti gli enzimi più comunemente adoperati per le colorazioni immunocitochimiche sono già presenti normalmente nelle cellule e questo può comportarti una riduzione della specificità della reazione.

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Quando utilizzi come enzima la perossidasi, incuba i campioni in acqua ossigenata allo 0,03% per 5 minuti. Procedi poi operando 3 lavaggi in PB di 5 minuti ciascuno. A questo punto incuba i campioni per 30 minuti con un siero immune (dell'animale nel quale è stato prodotto l'anticorpo secondario), per mascherare eventuali siti antigenici che potrebbero essere riconosciuti in modo aspecifico dall'anticorpo secondario. Dopo questo passaggio non effettuare nessun lavaggio. Ora puoi procedere incubando le sezioni con l'anticorpo primario diluito in PB e diretto contro la proteina di tuo interesse. Lascia i vetrini a 4°C, oppure se hai fretta, mettili in una stufa a 37°C per tre ore.

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A questo punto fai 3 lavaggi con PB ognuno di 5 minuti per eliminare l'anticorpo primario in eccesso, e incuba per un'ora con l'anticorpo secondario opportunamente marcato, e che sarà in grado di riconoscere l'anticorpo primario. Se l'anticorpo primario è un'immunoglobulina (Ig) di topo, il secondario sarà un anti-Ig di topo. A questo punto non ti resta che evidenziare il legame avvenuto tra antigene e anticorpo. Se l'anticorpo secondario è marcato con biotina puoi utilizzare il metodo ABC complex, cioè avidina-biotina perossidasi e diamminobenzidina (DAB). Per visualizzare l'avvenuta reazione, aggiungi al vetrino una soluzione contenente acqua ossigenata (3%) che è un substrato della perossidasi, e diamminobenzidina che è un cromogeno e produce un precipitato marrone.

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Consigli

Non dimenticare mai:
  • Leggere attentamente la guida.
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