Come Fare Un Elettroforesi Su Gel Di Poliacrilammide

tramite: O2O
Difficoltà: media
17

Introduzione

L'elettroforesi è una tecnica analitica e separativa, basata sul movimento di particelle elettricamente caricate immerse in un fluido, per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso. In questa guida, in particolare, vedremo come fare per riuscire ad eseguire correttamente un elettroforesi su gel di poliacrilammide.

27

Occorrente

  • Cameretta elettroforetica verticale
  • Separating gel
  • Stacking gel
  • Generatore di corrente
37

I gel di poliacrilamide sono costituiti da due parti: il Separeting gel, detto anche lower, dove avviene la separazione elettroforetica e lo Stacking gel, dove avviene la compattazione dei campioni. Ora supponiamo che noi dobbiamo fare un Separating gel al 15%, 10 mL di soluzione sarà così composta: 2,5 mL di Tris-Hcl1,5M pH 8,8; 50 µL di SDS 20%; 4 mL di acrilamide 30%; 10 µL diTEMED; 100 µL di APS; acqua fino ad arrivare a volume.
Aiutandoci con una pipetta Pasteur e cercando di non creare bollicine, versiamo la soluzione tra le due lastrine verticali che costituiscono l'apparecchio elettroforetico separate da uno spaziatore che ci consentirà di polimerizzare gel di spessore diverso (fino a 1,5mm) e attendiamo la polimerizzazione. Mentre il separeting polimerizza, procediamo con la preparazione dello stacking o altrimenti detto upper. 10 mL di soluzione sarà così composta: 2,5mL diTris-Hcl 0,5M pH6,8; 50 µL di SDS 20%; 2 mL di acrilamide 30%; 10 µL di TEMED;100 µL di APS; acqua fino ad arrivare a volume.

47

Quando il separeting ha polimerizzato, aiutandoci sempre con una pipetta Pasteur versiamo lo stacking nell'intercapedine tra le due lastrine sopra al separating. Anche in questa fase cerchiamo di essere molto veloci evitando che il gel si polimerizzi nella beuta. Appena versiamo lo stacking, calco nel gel una volta polimerizzato. Possiamo effettuare una separazione proteica in condizioni denaturanti che ci permetteranno di discriminare le proteine in base al loro peso molecolare. Possiamo infatti addizionare al campione un agente riducente come il mercaptoetanoloche denatura le proteine e ne agevola la linearizzazione e adoperare un tamponedi corsa con un detergente anionico come l'SDS (sodiododecilsolfato): le catene idrocarburiche dell'SDS infatti interagiranno con le regioni idrofobiche delle tue proteine alle quali verrà conferita una carica netta negativa che sarà ovviamente proporzionale alla loro lunghezza. Prima di caricare aggiungiamo ai campioni un Sample buffer costituito da: 2% di saccarosio; 0,625% di mercaptoetanolo; 2% di SDS; 0,25 M di EDTA e Blu di bromo fenolo. Portiamo ad ebollizione i campioni per circa 2 minuti per denaturare le proteine e consentirne la complessazione con l'SDS.

Continua la lettura
57

Adoperiamo una siringa Hamilton molto sottile, e inseriamo l'ago tra le due lastrine, assicurandoci sia di essere all'interno del pozzetto, ma anche di non bucarlo con la punta dell'ago. Insieme ai campioni carichiamo sempre un marker a peso molecolare noto per risalire al peso molecolare incognito delle tue catene polipeptidiche. Riempiamo la cameretta elettroforetica col tampone di corsa che avremo così preparato: 0,25M di Tris base; 1,9 M di Glicina; 1% di SDS; e acqua fino a 1 litro. Ora in un tale setaccio molecolare e in presenza di un campo elettrico, le proteine migreranno verso il polo positivo separandosi in base alla carica che l'SDS ha loro conferito. Possiamo quindi considerare che la distanza percorsa sarà inversamente proporzionale alle dimensioni delle proteine. Effettua una corsa a 20 mAper gel per circa 40-60 minuti.

67

Guarda il video

Potrebbe interessarti anche

Segnala contenuti non appropriati

Tipo di contenuto
Devi scegliere almeno una delle opzioni
Descrivi il problema
Devi inserire una descrizione del problema
Si è verificato un errore nel sistema. Riprova più tardi.
Segnala il video che ritieni inappropriato
Devi selezionare il video che desideri segnalare
Verifica la tua identità
Devi verificare la tua identità
chiudi
Grazie per averci aiutato a migliorare la qualità dei nostri contenuti

Guide simili

Università e Master

Come fare un'elettroforesi su gel d'agarosio

L'elettroforesi su gel d'agarosio rappresenta una particolare ed importante tecnica che vi permette di separare facilmente dei frammenti di DNA opportunamente amplificati mediante il metodo della PCR. A seconda della loro lunghezza i frammenti rimarranno...
Università e Master

Come effettuare un'analisi di Northern Blot

In questa guida vogliamo spiegare come poter effettuare un'analisi di Northern Blot: iniziamo subito con il dire che le analisi di Northern Blot sono estremamente utili negli studi dell'espressione genica, in quanto servono a determinare se un particolare...
Superiori

Come Sperimentare La Conducibilità Di Una Soluzione Elettrolitica

Questo esperimento serve per determinare la relazione che esiste tra una concentrazione di soluzione elettrolitica e l'intensità della corrente elettrica che la attraversa. Questo esperimento è estremamente semplice ed efficace e non necessita di apparecchiature...
Superiori

Come determinare il peso molecolare di una sostanza da misure crioscopiche

Il peso molecolare di un composto chimico è la massa di una singola molecola di tale composto, espressa in unità di massa atomica (UMA o Dalton). Il peso molecolare può essere calcolato come la somma delle masse atomiche di tutti gli atomi costituenti...
Università e Master

Come superare l'esame di patologia clinica

La patologia clinica (o medicina di laboratorio) rappresenta un esame che richiede la conoscenza molto approfondita della disciplina universitaria patologia generale: infatti, si tratta di due materie accademiche strettamente correlate ed interdipendenti....
Superiori

Come calcolare la formula molecolare

In questa semplice ed esauriente guida ci occuperemo di un argomento abbastanza particolare. La materia trattata è la chimica, e nello specifico tratteremo del calcolo della cosiddetta Formula Molecolare. Innanzitutto è fondamentale sapere che la Formula...
Università e Master

Come Sintetizzare Il M-nitrobenzoato Di Metile

La chimica è una delle materie più importanti per tutti coloro che decidono di intraprendere un percorso di studi scientifici, in particolare per gli studenti che frequentano l'istituto tecnico industriale oppure il liceo scientifico. Il M-nitrobenzoato...
Superiori

Come calcolare la massa molecolare di un composto chimico

Se siete alle prese con esercizi di chimica generale e nello specifico con il calcolo della massa molecolare, seguendo passo dopo passo questa guida potrete ottenere tutte le informazioni fondamentali per risolvere velocemente tutti i vostri quesiti....
I presenti contributi sono stati redatti dagli autori ivi menzionati a solo scopo informativo tramite l’utilizzo della piattaforma www.o2o.it e possono essere modificati dagli stessi in qualsiasi momento. Il sito web, www.o2o.it e Arnoldo Mondadori Editore S.p.A. (già Banzai Media S.r.l. fusa per incorporazione in Arnoldo Mondadori Editore S.p.A.), non garantiscono la veridicità, correttezza e completezza di tali contributi e, pertanto, non si assumono alcuna responsabilità in merito all’utilizzo delle informazioni ivi riportate. Per maggiori informazioni leggi il “Disclaimer »”.