Come Fare Un Elettroforesi Su Gel Di Poliacrilammide

tramite: O2O
Difficoltà: media
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Introduzione

L'elettroforesi è una tecnica analitica e separativa, basata sul movimento di particelle elettricamente caricate immerse in un fluido, per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso. In questa guida, in particolare, vedremo come fare per riuscire ad eseguire correttamente un elettroforesi su gel di poliacrilammide.

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Occorrente

  • Cameretta elettroforetica verticale
  • Separating gel
  • Stacking gel
  • Generatore di corrente
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I gel di poliacrilamide sono costituiti da due parti: il Separeting gel, detto anche lower, dove avviene la separazione elettroforetica e lo Stacking gel, dove avviene la compattazione dei campioni. Ora supponiamo che noi dobbiamo fare un Separating gel al 15%, 10 mL di soluzione sarà così composta: 2,5 mL di Tris-Hcl1,5M pH 8,8; 50 µL di SDS 20%; 4 mL di acrilamide 30%; 10 µL diTEMED; 100 µL di APS; acqua fino ad arrivare a volume.
Aiutandoci con una pipetta Pasteur e cercando di non creare bollicine, versiamo la soluzione tra le due lastrine verticali che costituiscono l'apparecchio elettroforetico separate da uno spaziatore che ci consentirà di polimerizzare gel di spessore diverso (fino a 1,5mm) e attendiamo la polimerizzazione. Mentre il separeting polimerizza, procediamo con la preparazione dello stacking o altrimenti detto upper. 10 mL di soluzione sarà così composta: 2,5mL diTris-Hcl 0,5M pH6,8; 50 µL di SDS 20%; 2 mL di acrilamide 30%; 10 µL di TEMED;100 µL di APS; acqua fino ad arrivare a volume.

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Quando il separeting ha polimerizzato, aiutandoci sempre con una pipetta Pasteur versiamo lo stacking nell'intercapedine tra le due lastrine sopra al separating. Anche in questa fase cerchiamo di essere molto veloci evitando che il gel si polimerizzi nella beuta. Appena versiamo lo stacking, calco nel gel una volta polimerizzato. Possiamo effettuare una separazione proteica in condizioni denaturanti che ci permetteranno di discriminare le proteine in base al loro peso molecolare. Possiamo infatti addizionare al campione un agente riducente come il mercaptoetanoloche denatura le proteine e ne agevola la linearizzazione e adoperare un tamponedi corsa con un detergente anionico come l'SDS (sodiododecilsolfato): le catene idrocarburiche dell'SDS infatti interagiranno con le regioni idrofobiche delle tue proteine alle quali verrà conferita una carica netta negativa che sarà ovviamente proporzionale alla loro lunghezza. Prima di caricare aggiungiamo ai campioni un Sample buffer costituito da: 2% di saccarosio; 0,625% di mercaptoetanolo; 2% di SDS; 0,25 M di EDTA e Blu di bromo fenolo. Portiamo ad ebollizione i campioni per circa 2 minuti per denaturare le proteine e consentirne la complessazione con l'SDS.

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Adoperiamo una siringa Hamilton molto sottile, e inseriamo l'ago tra le due lastrine, assicurandoci sia di essere all'interno del pozzetto, ma anche di non bucarlo con la punta dell'ago. Insieme ai campioni carichiamo sempre un marker a peso molecolare noto per risalire al peso molecolare incognito delle tue catene polipeptidiche. Riempiamo la cameretta elettroforetica col tampone di corsa che avremo così preparato: 0,25M di Tris base; 1,9 M di Glicina; 1% di SDS; e acqua fino a 1 litro. Ora in un tale setaccio molecolare e in presenza di un campo elettrico, le proteine migreranno verso il polo positivo separandosi in base alla carica che l'SDS ha loro conferito. Possiamo quindi considerare che la distanza percorsa sarà inversamente proporzionale alle dimensioni delle proteine. Effettua una corsa a 20 mAper gel per circa 40-60 minuti.

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