Come Estrarre Rna Da Un Tessuto

tramite: O2O
Difficoltà: difficile
19

Introduzione

Il fatto di estrarre l'RNA è il primo passo fondamentale allo scopo di identificare l'espressione di un gene in un determinato sistema biologico. Lavorare con le molecole di RNA è delicato, l'inconveniente principale in cui si incorre è la degradazione delle molecole durante la fase di estrazione. In questa guida, passo dopo passo, ti dirò come estrarre al meglio l'RNA da un tessuto.

29

Occorrente

  • Omogeneizzatore
  • Soluzione Lisante
  • Cloroformio
  • Isopropanolo
  • Etanolo 75%
  • Acqua DEPC
  • Centrifuga
  • Spettrofotometro
  • Cameretta Elettroforetica
  • Agarosio
39

Devi metterti a lavorare in un ambiente sterile, è opportuno infatti che tu prenda delle precauzioni per evitare le RNasi, le quali sono un po' dappertutto e fanno sì che vadano a degradarsi le molecole di RNA. Metti i guanti e cambiali quando c'è bisogno. Quindi, usa puntali, tubi, provette e vetreria autoclavata. Successivamente, provvedi a pulire con alcol le pipette da utilizzare. Mantieni il campione in ghiaccio. Non parlare proprio, visto e considerato che le RNasi infatti sono le peggiori "nemiche" dell'RNA e ci sono anche nella saliva.

49

Omogeneizza il tessuto. Puoi tranquillamente utilizzare sia mezzi automatizzati come l'ultraturrax che essendo più veloci ti facilitano non poco nel prevenire le contaminazioni. In alternativa, opta per omogeneizzatori a pestello Dounce mossi a mano. L'operazione molto rapida e la temperatura bassa sono i punti chiave di tale fase. Fai in modo di usare un reagente che agevoli la lisi cellulare, un mix di guanidina, thiocyanato e fenolo in una soluzione monofase.

Continua la lettura
59

Lascia i campioni omogenati per pochi minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungi 200µL di cloroformio per ciascun millilitro di soluzione lisante che hai utilizzato, quindi agita con le mani per alcuni secondi e lascia per un quarto d'ora a temperatura ambiente. Dovrai poi centrifugare a quattro gradi per quindici minuti a 12,000 x g. La fase di centrifugra è terminata.

69

Trasferisci in un tubo nuovo solo la fase acquosa avendo cura di prelevarla dal menisco ed evitando assolutamente di non aspirare le fasi sottostanti. Aggiungi 500 µL di isopropanolo per ogni millilitro di soluzione lisante utilizzata. Agita il tutto e lascia a temperatura ambiente per massimo dieci minuti. Centrifuga a 4°C per dieci minuti a 12,000 x g. Le molecole di RNA precipitate formeranno un pellet sul fondo del tubo. Butta il surnatante e lava il pellet di RNA aggiungendo un millilitro di etanolo 75%, vortexa e centrifuga a 7,500 x g per alcuni minuti.

79

Togli il surnatante e fai evaporare l'etanolo residuo. Risospendi il pellet di RNA con circa 20-30 µL di acqua DEPC, sulla base del pellet ottenuto. Carica poi il campione RNA su gel di agarosio e quantizza la concentrazione allo spettofotometro.

89

Guarda il video

99

Consigli

Non dimenticare mai:
  • Lavora sempre in assoluta sterilità!
  • Ricorda di sterilizzare tutto l' occorrente
Alcuni link che potrebbero esserti utili:

Potrebbe interessarti anche

Segnala contenuti non appropriati

Tipo di contenuto
Devi scegliere almeno una delle opzioni
Descrivi il problema
Devi inserire una descrizione del problema
Si è verificato un errore nel sistema. Riprova più tardi.
Segnala il video che ritieni inappropriato
Devi selezionare il video che desideri segnalare
Verifica la tua identità
Devi verificare la tua identità
chiudi
Grazie per averci aiutato a migliorare la qualità dei nostri contenuti

Guide simili

Università e Master

Come eseguire una trasformazione batterica mediante shock termico

Studiare e sperimentare i concetti centrali della biologia è davvero molto interessante quanto utile. La biologia è infatti una delle discipline più affascinanti per capire così il mondo che ci circonda. Per tale motivo in questa guida affronteremo...
Superiori

Appunti di chimica: la classificazione dei liquidi

In questa guida vedremo come vengono classificati i liquidi in chimica. Essi non sono altro che uno degli stati in cui si presenta la materia e che, specificatamente, se dovessero mancare tutte le forze esterne, si presenterebbero sotto forma sferica....
Elementari e Medie

Come Estrarre Il Dna Dalle Cellule Viventi

Il DNA è una lunga molecola che contiene il "progetto" di un determinato essere vivente, sia esso un vegetale, un animale o anche un microrganismo. Negli organismi superiori, il DNA è contenuto nel nucleo delle cellule, nei mitocondri e nei cloroplasti....
Università e Master

Come fare la conta cellulare

La conta delle cellule o conta microbica, può essere effettuata per le colture, come conta endoteliale (ovvero la conta delle cellule situate all'interno della cornea) e in molti altri differenti modi. Per chi è alle prime armi con questa tipologia...
Università e Master

Come fare un'elettroforesi orizzontale

L’elettroforesi è definita come la migrazione di particelle sotto l’influenza di un campo elettrico. La mobilità della particella dipende dalla forza elettrostatica netta che agisce sulla particella. Nell’elettroforesi su gel c’è un mezzo di...
Università e Master

Come Rilevare Il Numero Di Perossidi

Uno dei procedimenti più diffusi e complicati della chimica è la rilevazione del numero dei perossidi. I perossidi sono dei composti chimici costituiti da un legame covalente semplice tra due molecole di ossigeno. Nel legame covalente che si forma,...
Elementari e Medie

Come scomporre le misure di capacità

Le misure di capacità sono date dai multipli e dai sottomultipli del litro, che rappresenta l'unità di misura; questi valori servono per quantificare un liquido (come l'acqua). Nel caso della scomposizione, un dato va trasformato in tutti i suoi sottomultipli....
Superiori

Come calcolare il numero di molecole in una mole

L'argomento oggi affrontato riguarda la chimica, materia ritenuta assai ostica da molti studenti. Tuttavia con determinazione e buona capacità mnemoniche si possono raggiungere soddisfacenti risultati anche in questo campo. Questa guida sicuramente saprà...
I presenti contributi sono stati redatti dagli autori ivi menzionati a solo scopo informativo tramite l’utilizzo della piattaforma www.o2o.it e possono essere modificati dagli stessi in qualsiasi momento. Il sito web, www.o2o.it e Arnoldo Mondadori Editore S.p.A. (già Banzai Media S.r.l. fusa per incorporazione in Arnoldo Mondadori Editore S.p.A.), non garantiscono la veridicità, correttezza e completezza di tali contributi e, pertanto, non si assumono alcuna responsabilità in merito all’utilizzo delle informazioni ivi riportate. Per maggiori informazioni leggi il “Disclaimer »”.