Come Estrarre Rna Da Un Tessuto

tramite: O2O
Difficoltà: difficile
19

Introduzione

Il fatto di estrarre l'RNA è il primo passo fondamentale allo scopo di identificare l'espressione di un gene in un determinato sistema biologico. Lavorare con le molecole di RNA è delicato, l'inconveniente principale in cui si incorre è la degradazione delle molecole durante la fase di estrazione. In questa guida, passo dopo passo, ti dirò come estrarre al meglio l'RNA da un tessuto.

29

Occorrente

  • Omogeneizzatore
  • Soluzione Lisante
  • Cloroformio
  • Isopropanolo
  • Etanolo 75%
  • Acqua DEPC
  • Centrifuga
  • Spettrofotometro
  • Cameretta Elettroforetica
  • Agarosio
39

Devi metterti a lavorare in un ambiente sterile, è opportuno infatti che tu prenda delle precauzioni per evitare le RNasi, le quali sono un po' dappertutto e fanno sì che vadano a degradarsi le molecole di RNA. Metti i guanti e cambiali quando c'è bisogno. Quindi, usa puntali, tubi, provette e vetreria autoclavata. Successivamente, provvedi a pulire con alcol le pipette da utilizzare. Mantieni il campione in ghiaccio. Non parlare proprio, visto e considerato che le RNasi infatti sono le peggiori "nemiche" dell'RNA e ci sono anche nella saliva.

49

Omogeneizza il tessuto. Puoi tranquillamente utilizzare sia mezzi automatizzati come l'ultraturrax che essendo più veloci ti facilitano non poco nel prevenire le contaminazioni. In alternativa, opta per omogeneizzatori a pestello Dounce mossi a mano. L'operazione molto rapida e la temperatura bassa sono i punti chiave di tale fase. Fai in modo di usare un reagente che agevoli la lisi cellulare, un mix di guanidina, thiocyanato e fenolo in una soluzione monofase.

Continua la lettura
59

Lascia i campioni omogenati per pochi minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungi 200µL di cloroformio per ciascun millilitro di soluzione lisante che hai utilizzato, quindi agita con le mani per alcuni secondi e lascia per un quarto d'ora a temperatura ambiente. Dovrai poi centrifugare a quattro gradi per quindici minuti a 12,000 x g. La fase di centrifugra è terminata.

69

Trasferisci in un tubo nuovo solo la fase acquosa avendo cura di prelevarla dal menisco ed evitando assolutamente di non aspirare le fasi sottostanti. Aggiungi 500 µL di isopropanolo per ogni millilitro di soluzione lisante utilizzata. Agita il tutto e lascia a temperatura ambiente per massimo dieci minuti. Centrifuga a 4°C per dieci minuti a 12,000 x g. Le molecole di RNA precipitate formeranno un pellet sul fondo del tubo. Butta il surnatante e lava il pellet di RNA aggiungendo un millilitro di etanolo 75%, vortexa e centrifuga a 7,500 x g per alcuni minuti.

79

Togli il surnatante e fai evaporare l'etanolo residuo. Risospendi il pellet di RNA con circa 20-30 µL di acqua DEPC, sulla base del pellet ottenuto. Carica poi il campione RNA su gel di agarosio e quantizza la concentrazione allo spettofotometro.

89

Guarda il video

99

Consigli

Non dimenticare mai:
  • Lavora sempre in assoluta sterilità!
  • Ricorda di sterilizzare tutto l' occorrente
Alcuni link che potrebbero esserti utili:

Potrebbe interessarti anche

Segnala contenuti non appropriati

Tipo di contenuto
Devi scegliere almeno una delle opzioni
Descrivi il problema
Devi inserire una descrizione del problema
Si è verificato un errore nel sistema. Riprova più tardi.
Segnala il video che ritieni inappropriato
Devi selezionare il video che desideri segnalare
Verifica la tua identità
Devi verificare la tua identità
chiudi
Grazie per averci aiutato a migliorare la qualità dei nostri contenuti

Guide simili

Università e Master

Tessuto muscolare: anatomia

Il tessuto muscolare rappresenta uno dei più importanti tessuti del corpo umano, infatti esso è parte costituente del cuore e di moltissimi altri apparati che ci permettono di compiere azioni volontarie e non. La suddivisione che comunemente si utilizza...
Università e Master

Come affettare un tessuto al criostato

Il microtomo criostato è uno strumento che seziona i tessuti. In particolare serve per ricavare diverse sezioni dai loro campioni. Si presenta all'interno di una camera criostatica. Con il suo meccanismo si rende il tessuto particolarmente rigido, grazie...
Università e Master

Come Affettare Al Microtomo Un Campione Di Tessuto Incluso In Paraffina

Perché un tessuto possa essere osservato al microscopio ottico deve essere sufficientemente sottile da permettere alla luce di attraversarlo. Per questo motivo, prima dell'esame microscopico, i tessuti vengono sempre suddivisi in sezioni sottilissime,...
Università e Master

Come effettuare un'analisi di Northern Blot

In questa guida vogliamo spiegare come poter effettuare un'analisi di Northern Blot: iniziamo subito con il dire che le analisi di Northern Blot sono estremamente utili negli studi dell'espressione genica, in quanto servono a determinare se un particolare...
Università e Master

Come Calcolare L'Interferenza In Un'Analisi Genetica

La genetica è una complessa branca della biologia che si occupa dello studio dei geni e del loro comportamento. Tra i vari oggetti di indagine spiccano l'ereditarietà e la variabilità genetica. Tali fenomeni innescano particolari meccanismi, i quali...
Università e Master

Appunti di biochimica: il Dna polimerasi

Prima di iniziare a capire nello specifico cos'è il DNA polimerasi e le sue proprietà, cerchiamo di comprendere cosa intendiamo dire col termine biochimica. La biochimica nasce dall'unione di due termini largamente usati in ambito scientifico, ovvero...
Università e Master

Come preparare l'esame di biologia molecolare

Ogni esame richiede una preparazione molto approfondita per conoscere nel dettaglio tutte le sfumature che quella determinata materia contiene. Quello della biologia poi è un campo assai vasto e difficile, che richiede molta pazienza e molta pratica....
Università e Master

Appunti di biologia molecolare

La biologia è lo studio di molecole situate nel nostro organismo o in altri elementi che la natura ci offre. In questi appunti di biologia molecolare andremo a vedere in modo semplificato ma comprensivo di cosa si occupa questo studio, abbiamo sentito...
I presenti contributi sono stati redatti dagli autori ivi menzionati a solo scopo informativo tramite l’utilizzo della piattaforma www.o2o.it e possono essere modificati dagli stessi in qualsiasi momento. Il sito web, www.o2o.it e Arnoldo Mondadori Editore S.p.A. (già Banzai Media S.r.l. fusa per incorporazione in Arnoldo Mondadori Editore S.p.A.), non garantiscono la veridicità, correttezza e completezza di tali contributi e, pertanto, non si assumono alcuna responsabilità in merito all’utilizzo delle informazioni ivi riportate. Per maggiori informazioni leggi il “Disclaimer »”.