Come estrarre RNA da un tessuto

Tramite: O2O
Difficoltà: difficile
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Introduzione

L'RNA è il principale responsabile della sintesi proteica degli organismi. ARN in lingua italiana è l'acronimo per indicare l'acido ribonucleico, una molecola a singola catena. L'estrazione dell'RNAda un tessuto è fondamentale per lo studio dei geni e la regolazione dell'espressione genica. La delicatezza di questa operazione non è semplice per lo studente o per lo scienziato in formazione. Occorre attenzione, sangue freddo e rigore. L'inconveniente principale in cui si incorre è la degradazione delle molecole durante la fase di estrazione. La degradazione comporta la perdita di informazione e di un risultato corretto della procedura. In questa guida chiariremo i passi fondamentali per come estrarre Rnada un tessuto.

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Occorrente

  • Omogeneizzatore
  • Soluzione Lisante
  • Cloroformio
  • Isopropanolo
  • Etanolo 75%
  • Acqua DEPC
  • Centrifuga
  • Spettrofotometro
  • Cameretta Elettroforetica
  • Agarosio
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Le azioni preliminari

Qualsiasi operatore scientifico sa che il primo errore dell'inesperto consiste nella mancata accortezza durante le operazioni.Bisogna tener conto che l'estrazione dell'RNAda un tessuto ha un senso solo se lavoriamo in un ambiente sterile. La precauzione non è mai troppa!Indossa i guanti e cambiali ogni volta che ne senti la necessità. Un errore di valutazione in questa fase può rendere inutile ogni sforzo successivo. L'utilizzo di puntali, tubi, provette e vetreria autoclavata sono essenziali per procedere in sicurezza.Le RNAsi vanno a degradare le molecole di RNA. Le RNAsi contenute nella saliva inficiano i risultati. Indossare una mascherina può essere un buon metodo per evitare spiacevoli contaminazioni, altrimenti stai in silenzio. Successivamente, provvedi a pulire con alcol le pipette da utilizzare e mantieni il campione in ghiaccio.

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La conservazione

Omogeneizza il tessuto: puoi tranquillamente utilizzare sia mezzi automatizzati come l'ultraturrax che omogeneizzatori a pestello Dounce mossi a mano. La differenza sostanziale tra queste due alternative è la velocità delle operazioni. L'ultraturrax è più rapido e quindi si rischia meno di contaminare il tessuto. Non sottovalutare la bassa temperatura durante la conservazione del tessuto né l'utilizzo del giusto reagente per determinare la lisi cellulare. Ad esempio, un mix di guanidina, thiocyanato e fenolo in una soluzione monofase potrebbero fare al caso tuo.

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La centrifugazione

Lascia i campioni omogenati per pochi minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungi 200µL di cloroformio per ciascun millilitro di soluzione lisante che hai utilizzato. Poi agita con le mani per alcuni secondi e lascia per un quarto d'ora a temperatura ambiente. Dovrai, infine, centrifugare a quattro gradi per quindici minuti a 12,000 x g. La centrifugazione del campione di Rnada tessuto termina qui.

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La precipitazione

Trasferisci in un tubo nuovo solo la fase acquosa avendo cura di prelevarla dal menisco. Evita assolutamente di aspirare le fasi sottostanti. Aggiungi 500 µL di isopropanolo per ogni millilitro di soluzione lisante utilizzata. Agita il tutto e lascia a temperatura ambiente per massimo dieci minuti. Centrifuga a 4°C per dieci minuti a 12,000 x g. Le molecole di RNAda tessuto precipitate formeranno un pellet sul fondo del tubo.

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Il caricamento

Butta il surnatante e lava il pellet di RNA aggiungendo un millilitro di etanolo 75%, vortexa e centrifuga a 7,500 x g per alcuni minuti. Togli il surnatante e fai evaporare l'etanolo residuo. Risospendi il pellet di RNA con circa 20-30 µL di acqua DEPC, sulla base del pellet ottenuto. Carica poi il campione RNAda tessuto su gel di agarosio e quantizza la concentrazione allo spettofotometro.

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