Come fare una trasformazione batterica tramite shock termico

Tramite: O2O 06/05/2018
Difficoltà: media
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Introduzione

Studiare e sperimentare i concetti centrali della biologia è davvero molto interessante quanto utile. La biologia è infatti una delle discipline più affascinanti per capire così il mondo che ci circonda. Per tale motivo in questa guida affronteremo insieme come eseguire una trasformazione batterica mediante shock termico. La cellula batterica è un organismo procariote, è quindi priva membrana nucleare e il DNA si trova nel citoplasma in una regione chiamata nucleoide. La trasformazione batterica è una tecnica di biologia molecolare messa a punto per facilitare l'ingresso di uno specifico plasmide all'interno dei batteri, che possono naturalmente ottenere nuove informazioni generiche attraverso 3 diversi meccanismi: coniugazione, trasduzione e trasformazione. Il trasferimento del DNA direttamente da un organismo ad un altro è chiamato coniugazione, ma nella trasduzione il trasferimento del DNA avviene con l'aiuto del batteriofago. Ecco dunque come eseguire una trasformazione batterica mediante shock termico.

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Realizzazione della sospensione

Preleva circa 200 µLdi cellule batteriche rese competenti con CaCl2 e mettile in una provetta sterile. Lasciale scongelare in ghiaccio per circa 15 minuti. Aggiungi 10 µL di una soluzione 0.5 ng/µl contenente il plasmide che desideri che le cellule batteriche assimilino. Mescola con delicatezza la sospensione evitando che subisca innalzamenti ditemperatura. Si consiglia di non "spipettare" mai nelle cellule, ma di agitarle dando dei piccoli colpetti col dito sulla provetta.

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Trasferimento delle provette

Riponi immediatamente le provette in ghiaccio per circa 30 minuti. Dopodiché trasferisci le provette in un bagnetto termostatato a 42°C per 2,30 minuti. Questo passaggio è cruciale, in quanto lo shock termico veloce da 0 a 42°C permette l'ingresso del plasmide nelle cellule competenti. Si consiglia di arrivare al bagnetto con i campioni ancora in ghiaccio. In ogni caso non superare i 2,30 minuti, altrimenti le cellule muoiono. La durata di questa fase è quindi importante nell'efficienza della trasformazione.

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Rallentamento del metabolismo cellulare

A questo punto trasferisci le provette in ghiaccio e lascia raffreddare per 1-2 minuti: in questo modo si favorisce di nuovo il rallentamento del metabolismo cellulare. È inoltre necessario fornire nutrienti alle cellule affinché possano iniziare il loro processo di divisione. Aggiungi quindi 1 ml di terreno liquido LB, agita delicatamente, e incuba a 37°C per 1 ora in agitazione. È' importantissimo prestare attenzione a non incubare le cellule in un terreno selettivo, quindi non aggiungere l'antibiotico al terreno, perché devi attendere l'espressione del geneche codifica per la resistenza. Nel caso in cui il plasmide porti resistenza per l'ampicillina, si dovrà allora attendere che il gene esprima la %u03B2-lattamasi, per poi attivare la resistenza all'ampicillina dovrai attendere circa 1 ora.

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Preparazione delle piastre

Arrivati a questo punto piastra le cellule su terreno solido (LB più agar) e incubale per circa 16 ore a 37°C. Ricordati di posizionare le capsule capovolte per evitare la formazione della condensa. Sarebbe bene poi preparare due piastre a concentrazioni differenti e una di controllo. L'importante è poi piastrare dapprima 100 µLdi campione, poi centrifugare per 30 secondi la sospensione rimanente. Getta il surnatante, in modo da lasciare nella provetta circa 100 µL di LB con cui risospenderai il pellet batterico ottenuto (piastra più concentrata) e piastra. Puoi conservare le piastre con le colonie a 4°C.

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Trasformazione batterica

Durante la trasformazione, il DNA nudo è legato alla superficie cellulare ed è attraversato dal complesso membrana-parete. La trasformazione può avvenire naturalmente o artificialmente nei batteri. La trasformazione naturale è un meccanismo raro utilizzato da alcune cellule batteriche per prelevare il DNA dall'ambiente. Nella trasformazione artificiale, le cellule batteriche dovrebbero essere sensibili in determinate condizioni di laboratorio prima della trasformazione. Esistono due metodi principali per la trasformazione artificiale nei batteri: CaCl2, in cui il trattamento è eseguito da breve shock termico ed elettroporazione. Uno dei due metodi è stato modificato nel corso del secolo scorso per ottenere una maggiore efficienza di trasformazione.

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Assorbimento delle molecole

L'esatto meccanismo di come il trattamento con CaCl 2 potrebbe facilitare il trasferimento del DNA dall'ambiente extracellulare al citoplasma, non è ancora stato rivelato. Si presume che le molecole di DNA possano essere assorbite sulla superficie cellulare con l'aiuto del catione bivalente Ca 2+ e la fase di shock termico, che rendono possibile l'ingresso di DNA nel citosol. In questo studio, i batteri di E. Coli sono stati trasformati usando due metodi: il trattamento con CaCl 2 seguito da step di shock termico e il trattamento con CaCl 2, senza utilizzo di shock termico. L'efficienza di trasformazione è stata calcolata per entrambi i metodi. Sembra che la fase di shock termico non possa avere il ruolo cruciale per il protocollo di trasformazione. Il ceppo BL21 dei batteri di E. Coli è stato utilizzato per la trasformazione.

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