A questo punto trasferisci le provette in ghiaccio e lascia raffreddare per 1-2 minuti: in questo modo si favorisce di nuovo il rallentamento del metabolismo cellulare. È inoltre necessario fornire nutrienti alle cellule affinché possano iniziare il loro processo di divisione. Aggiungi quindi 1 ml di terreno liquido LB, agita delicatamente, e incuba a 37°C per 1 ora in agitazione. È' importantissimo prestare attenzione a non incubare le cellule in un terreno selettivo, quindi non aggiungere l'antibiotico al terreno, perché devi attendere l'espressione del geneche codifica per la resistenza. Nel caso in cui il plasmide porti resistenza per l'ampicillina, si dovrà allora attendere che il gene esprima la %u03B2-lattamasi, per poi attivare la resistenza all'ampicillina dovrai attendere circa 1 ora.