Come eseguire una trasformazione batterica mediante shock termico

tramite: O2O
Difficoltà: media
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Introduzione

Studiare e sperimentare i concetti centrali della biologia è davvero molto interessante quanto utile. La biologia è infatti una delle discipline più affascinanti per capire così il mondo che ci circonda. Per tale motivo in questa guida affronteremo insieme come eseguire una trasformazione batterica mediante shock termico. La cellula batterica è un organismo procariote, è quindi priva membrana nucleare e il DNA si trova nel citoplasma in una regione chiamata nucleoide. La trasformazione batterica è una tecnica di biologia molecolare messa a punto per facilitare l'ingresso di uno specifico plasmide all'interno dei batteri. Segui quindi tutti i semplici ed utili passaggi di questa guida con attenzione, in modo da imparare così tutti gli accorgimenti da adottare per ottenere un'efficiente resa di trasformazione.

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Preleva circa 200 µLdi cellule batteriche rese competenti con CaCl2 e mettile in una provetta sterile. Lasciale scongelare in ghiaccio per circa 15 minuti. Aggiungi 10 µL di una soluzione 0.5 ng/µl contenente il plasmide che desideri che le cellule batteriche assimilino. Mescola con delicatezza la sospensione evitando che subisca innalzamenti ditemperatura. Ti suggerisco di non "spipettare" mai nelle cellule, ma di agitarle dando dei piccoli colpetti col dito sulla provetta.

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Riponi poi immediatamente le provette in ghiaccio per circa 30 minuti. Dopodichè trasferisci le provette in un bagnetto termostatato a 42°C per 2,30 minuti. Questo passaggio è cruciale, in quanto lo shock termico veloce da 0 a 42°C permette l'ingresso del plasmide nelle cellule competenti. Ti consiglio di arrivare al bagnetto con i campioni ancora in ghiaccio. Ogni caso non superare i 2,30 minuti, altrimenti le cellule muoiono. La durata di questa fase è quindi importante nell'efficienza della trasformazione.

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A questo punto trasferisci subito le provette in ghiaccio, e lascia raffreddare per 1-2 minuti: in questo modo si favorisce di nuovo il rallentamento del metabolismo cellulare. È inoltre necessario fornire nutrienti alle cellule affinché possano iniziare il loro processo di divisione. Aggiungi quindi 1 mL di terreno liquido LB, agita delicatamente, e incuba a 37°C per 1 ora in agitazione.

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È poi importantissimo prestare attenzione a non incubare le cellule in un terreno selettivo, quindi non aggiungere l'antibiotico al terreno, perché devi attendere l'espressione del geneche codifica per la resistenza. Nel caso in cui il plasmide porti resistenza per l'ampicillina, si dovrà allora attendere che il gene esprima la %u03B2-lattamasi, per poi attivare la resistenza all'ampicillina dovrai attendere circa 1 ora.

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Arrivati a questo punto piastra le cellule su terreno solido (LB più agar) e incubale per circa 16 ore a 37°C. Ricordati di posizionare le capsule Petri capovolte per evitare la formazione della condensa. Sarebbe bene poi preparare due piastre a concentrazioni differenti e una di controllo. Importante è poi piastrare dapprima 100 µLdi campione poi centrifuga per 30 secondi la sospensione rimanente, butta il surnatante in modo da lasciare nella provetta circa 100 µL di LB con cui risospenderai il pellet batterico ottenuto (piastra più concentrata) e piastra. Puoi conservare le piastre con le colonie a 4°C. Ecco terminata questa guida con cui avrete così incrementato le vostre conoscenze utili per realizzare i vostri studi nel modo più efficiente e corretto. Continuate a studiare una materia così affascinante come la biologia e divertitevi a provare e riprovare i vostri esperimenti.

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