Come effettuare un'analisi di Northern Blot

tramite: O2O
Difficoltà: media
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Introduzione

In questa guida vogliamo spiegare come poter effettuare un'analisi di Northern Blot: iniziamo subito con il dire che le analisi di Northern Blot sono estremamente utili negli studi dell'espressione genica, in quanto servono a determinare se un particolare gene è trascritto in tutti i tessuti dell'organismo o solo in alcuni di essi. La tecnica prevede tre punti fondamentali: elettroforesi di RNA in condizioni denaturanti; trasferimento di RNA da gel a membrana di nylon; ibridazione con sonde di interesse.

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Occorrente

  • Agarosio
  • MOPS
  • Formaldeide
  • SSC
  • Carta Whatmann 3 mm
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La prima cosa che dovete fare è quella di preparare un gel all'1,2% di agarosio, aggiungete del formaldeide e MOPS 10X, in quantità tali da ottenere una concentrazione finale rispettivamente di 2.2M di formaldeide e 1X di MOPS e colate per bene il gel nello stampo. Fate attenzione, durante lo svolgimento di quest'operazione, perché la formaldeide è tossica e quindi va aggiunta sotto cappa chimica. Mescolate ad 1 volume di RNA, 1 volume di sample-buffer (per esempio 5 µl di RNA più 5 µl di sample buffer) ed incubate per 10 minuti a 65°C. Ponete in ghiaccio per 30 secondi e centrifugate brevemente per recuperare la condensa.

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Caricate il campione sul gel ed eseguite, con estrema cura, la corsa elettroforetica in tampone MOPS 1X. Fate correre i campioni per circa 2/3 del gel, impiegando un voltaggio elevato per minimizzare la durata della corsa. Con il passare del tempo, infatti noterete che la formaldeide evapora dal gel, riuscendo ad alterare la corsa dell'RNA. Dopo la corsa elettroforetica, lavate il gel in acqua per 5 minuti, cambiando l'acqua ogni minuto e mantenendo in agitazione (%u2264 50 rpm). Lavate anche il gel in SSC 10X in agitazione.

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Assemblate successivamente l'apparato del blotting, usando una soluzione di trasferimento SSC 20X o 10X. Per preparare l'apparato di trasferimento, imbevete di soluzione di trasferimento SSC 20X (o 10X), il ponte di carta Whatmann 3mm, fatelo poi aderire al supporto per evitare la formazione di bolle. Appoggiate quindi il gel, evitando la formazione di bolle, coprite la superficie del ponte e del supporto con un po' di pellicola trasparente, per impedire l'efflusso laterale della soluzione di trasferimento e forzatela quindi tra le maglie del gel.

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Distendete sopra al gel, la membrana che potete bagnare in tampone di trasferimento o applicarla asciutta. Appoggiate sopra la membrana tre fogli di carta Whatmann 3 mm della stessa dimensione della membrana, eventualmente imbevuti in SSC 20X. Impilate un numero di fogli di carta assorbente asciutti e infine applicate anche un peso, lasciando che il trasferimento avvenga per 12-16 ore. A questo punto smontate l'apparato, avvolgete il filtro in pellicola trasparente e ponetelo agli UV per 2-3 minuti con l'RNA rivolto verso la lampada.

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Pre-ibridate la membrana a 65-68°C per almeno 30 minuti, aggiungete la sonda opportunamente marcata e incubate over night. Effettuate circa due lavaggi di 15 minuti ciascuno con SSC 2X e SDS 0,1% ed infine lavate anche per 15 minuti con SSC 0,2X e SDS 0,1%. Dopo l'eliminazione della sonda in eccesso, rivelate l'ibrido mediante autoradiografia, rivelazione della chemio luminescenza e della colorimetria, a seconda del tipo di sonda che avete adoperato.

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