Come effettuare un'analisi di Northern Blot

Tramite: O2O
Difficoltà: media
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Introduzione

In questa guida spiegheremo come effettuare un'analisi di Northern Blot, variante della tecnica Southern e inventata nel 1977 da un gruppo di scienziati dell'Università di Standford, che assume come bersaglio l'RNA.
L'analisi di Northern Blotting è una delle tecniche più usate dai biologi molecolari di tutto il mondo, per studiare l'espressione genica, analizzando qualitativamente e quantitativamente la presenza di specifiche molecole di RNA, le cosiddette RNA-bersaglio, nell'insieme totale di RNA di una cellula o di un organismo. Misurare l'espressione di un gene significa dare una valutazione quantitativa della presenza di trascritti (molecole di mRNA) o delle proteine codificate da quel gene nelle cellule in esame.
La tecnica prevede diverse fasi fondamentali: l'isolazione e la separazione tramite elettroforesi di RNA in condizioni denaturanti; il trasferimento di RNA da gel a supporto solido di nylon o nitrocellulosa; l'ibridazione con particolari sonde di interesse e rilevazione finale.

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Occorrente

  • Gel di agarosio
  • Formaldeide
  • Soluzione salina
  • Carta Whatman 3 mm
  • Carta assorbente
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Isolazione e separazione delle molecole di RNA

La prima fase prevede l'isolazione delle molecole di RNA da un campione scelto di cellule o di tessuti, per poter cominciare a studiare l'RNA-messaggero tramite l'analisi di Northern Blot. Una volta estratto l'RNA-messaggero dalle cellule, è possibile procedere con la separazione delle varie molecole di RNA usando un gel denaturante per elettroforesi. Il gel più comunemente usato in questa tecnica è il gel di agarosio, con una concentrazione variabile dallo 0,6% al 2% a seconda della lunghezza dell'RNA da identificare, arricchito di formaldeide, gliossale o talvolta anche urea 8M, che aiuta a mantenere la struttura a singola elica dell'RNA, evitando così la formazione di strutture secondarie. Questo fa sì che le molecole abbiano una velocità di migrazione elettroforetica proporzionale alla loro grandezza. A questo punto, utilizzando il bromuro di etidio, molecola capace di emettere una luce fluorescente quando esposto a luce ultravioletta, possiamo evidenziare le specie molecolari più abbondanti presenti nel campione.

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Trasferimento su supporto solido

La fase successiva riguarda il trasferimento, detto anche blotting o elettroblotting, su supporto solido, ovvero su membrana, delle molecole di RNA. Queste verranno trasferite dal gel a un filtro di nylon, o di nitrocellulosa, delle stesse dimensioni del gel, mediante assorbimento capillare. Per prima cosa, viene assemblato l'apparato del blotting, usando una soluzione salina di cui sarà imbevuto il ponte di carta Whatman 3mm. Su questo verrà appoggiato il gel che, per avere un trasferimento efficiente, deve essere sottile e non superare una concentrazione di 1,2% di agaroso. Sul gel, contenente le molecole di RNA, verrà poi posata la membrana e, su questa, tre fogli di carta Whatman 3 mm della sua stessa dimensione. Per facilitare l'assorbimento capillare è utile mettere alcuni fogli di carta assorbente asciutti sul filtro e applicare un peso, in modo da velocizzare il trasferimento delle molecole dal gel al filtro. Affinché il trasferimento riesca efficacemente, occorre attendere dalle 12 alle 16 ore. Dopodiché, le molecole di RNA vengono fissate al filtro covalentemente, per mezzo di irradiamento con luce ultravioletta.

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Ibridazione con sonda

Avvenuto il trasferimento capillare dell'RNA dal gel al supporto solido, è possibile procedere con l'ultima fase: l'ibridazione con sonda, che consiste nel mettere in evidenza le molecole della specie di RNA che si desidera studiare. Ciò è possibile grazie alla proprietà delle molecole di acido nucleico di appaiarsi con molecole che hanno una sequenza ad esse complementare. Le sonde impiegate possono essere di DNA, RNA o oligonucleotidi. Solitamente, la sonda viene marcata con un isotopo radioattivo o con altri nucleotidi marcati con sostanze, o molecole, non radioattive facilmente individuabili tramite varie tecniche. La reazione di ibridazione avviene in presenza di formamide, fondamentale per abbassare la temperatura di incubazione ed evitare la degradazione del campione o delle sonde di RNA.

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Lavaggio del filtro

Una volta giunta al termine la reazione di ibridazione, devono essere eliminati dal filtro la soluzione di ibridazione e l'eccesso di sonda che non ha reagito, in modo che questi non interferiscano con la rilevazione finale delle molecole di RNA. A questo scopo, vengono effettuati diversi lavaggi. Si distingue tra:
- lavaggi a bassa stringenza per eliminare la soluzione di ibridazione e le sonde non legate;
- lavaggi ad alta stringenza per eliminare le sonde parzialmente legate.
Potrebbe essere necessario effettuare più cicli di lavaggi, della durata di almeno 15 minuti, per eliminare ogni residuo in eccesso.

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Rilevazione

L'ultima fase prevede l'esposizione del filtro a una lastra autoradiografica, se la sonda utilizzata era di tipo radioattivo, a chemioluminescenza, fluorescenza o produzione di calore, nel caso di sonda non radioattiva. Dopo aver sviluppato la lastra, le molecole della sonda, che hanno ibridato con l'RNA-bersaglio presente sul filtro, formeranno una banda scura che ne evidenzierà la posizione e la cui intensità sarà proporzionale alla quantità di RNA bersaglio.

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